论文部分内容阅读
目的：本研究通过观察通心络胶囊联合外周血干细胞移植对糖尿病足溃疡模型大鼠一般状态、溃疡愈合、微血管密度，以及溃疡局部组织氧化、炎症、血管新生相关因子表达的影响，从抑制氧化应激反应，改善局部微环境角度探讨通心络促进干细胞移植后糖尿病足溃疡局部组织血管新生，促进溃疡愈合的可能作用机制。方法：1通心络胶囊联合外周血干细胞移植治疗大鼠糖尿病足溃疡的干预作用高脂饲料喂养联合45mg/kg链脲佐菌素（STZ）腹腔注射，建立糖尿病大鼠模型，液氮棉签冷冻法建立糖尿病大鼠足溃疡模型。造模后，将成模大鼠随机分为：模型组(Model)：给予等体积的0.5%CMC-Na溶液灌胃+等体积无菌RPM1640培养基注射；通心络组（TXL）：给予通心络0.8g/kg体重灌胃+等体积无菌RPM1640培养基注射；干细胞组(Stem)：给予等体积的0.5%CMC-Na溶液灌胃+干细胞移植；通心络+干细胞组(T+S)：给予通心络0.8g/kg体重灌胃+干细胞移植，设同批次大鼠造成足溃疡为对照组(Control)：给予等体积的0.5%CMC-Na溶液灌胃+等体积无菌RPM1640培养基注射。干细胞移植方法：于足溃疡边缘1mm等距4个位点注射共约0.1ml细胞悬液,小腿肌肉内6个位点，每个点注射0.05ml细胞悬液。分别于治疗7d、28d后观察大鼠一般状态，空腹血糖、体重、血脂的变化，血清胰岛素水平，足部溃疡创面愈合情况，HE染色及冰冻切片观察组织形态学变化。2通心络胶囊联合外周血干细胞移植治疗对大鼠糖尿病足溃疡血管新生的影响实验造模、分组、给药及取材方法同第一部分，ELISA法检测血清VEGF水平，实时荧光PCR检测溃疡局部组织VEGFmRNA的表达，免疫组织化学法检测大鼠糖尿病足溃疡局部组织CD34表达，Western-blot法检测溃疡局部组织CD34、CD44、CD105表达。3通心络胶囊联合外周血干细胞移植治疗对糖尿病足溃疡大鼠氧化损伤及细胞粘附分子的影响实验造模、分组、给药及取材方法同第一部分，ELISA法检测血清ROS、AGE、RAGE水平，实时荧光PCR检测RAGEmRNA表达，Western-blot法检测溃疡局部组织: ICAM-1、VCAM-1、Nrf-2、HO-1蛋白表达。结果：1通心络胶囊联合外周血干细胞移植治疗对大鼠糖尿病足溃疡的干预作用各组大鼠体重、空腹血糖结果：治疗7d、28d后，与对照组比较，模型组血糖升高、体重降低（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，通心络+干细胞组血糖降低、体重增加（均P<0.05），通心络组体重增加（P<0.05）；与干细胞组比较通心络+干细胞组体重增加（P<0.05）。各组大鼠血脂结果：治疗7d、28d后，与对照组比较，模型组血清TG、CHOL、LDL升高，HDL降低（均P<0.01）；与模型组比较，通心络组和通心络+干细胞组血清TG、CHOL、LDL降低，HDL升高（P<0.05或P<0.01）；与干细胞组比较，通心络+干细胞组血清TG、CHOL、LDL降低，HDL升高（P<0.05或P<0.01）。各组大鼠血清胰岛素结果：治疗7d、28d后，与对照组比较，模型组血清胰岛素降低(P<0.01)；分别与模型组、干细胞组比较，通心络+干细胞组血清胰岛素增加(P<0.05或P<0.01)。治疗7d后各组大鼠溃疡愈合及镜下病理观察：与对照组比较，模型组溃疡愈合较差；与模型组比较，各治疗组溃疡愈合较好，表皮覆盖完整，以通心络+干细胞组效果最好。HE染色病理观察，与对照组比较，模型组肉芽组织较少，炎细胞浸润较多；与模型组比较各治疗组肉芽组织丰富，炎细胞浸润较少。干细胞移植后7d冰冻切片荧光显微镜下可见干细胞组和干细胞+通心络组视野内溃疡组织区域有大量的蓝色荧光聚集，通心络+干细胞组荧光强度高于干细胞组。提示：通心络联合外周血干细胞移植能够促进溃疡组织局部肉芽组织新生，促进溃疡愈合。2通心络胶囊联合外周血干细胞移植治疗对大鼠糖尿病足溃疡血管新生的影响各组大鼠血清VEGF水平检测：治疗后7d、28d，与对照组比较，模型组VEGF水平降低(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组血清VEGF水平均增加(P<0.05或P<0.01)；与干细胞组比较通心络组及通心络+干细胞组血清VEGF水平增加（P<0.05或P<0.01）。各组大鼠溃疡局部组织中VEGFmRNA表达：治疗后7d、28d，与对照组比较，模型组VEGFmRNA明显降低(P<0.01)；分别与模型组、干细胞组比较，通心络组和通心络+干细胞增加溃疡局部组织中VEGFmRNA表达增加(P<0.05或P<0.01)。各组大鼠溃疡局部组织免疫组织化学检测CD34的表达：CD34蛋白阳性表现为棕黄色染色，主要在糖尿病足溃疡局部组织新生血管内皮细胞表达。与对照组比较，模型组溃疡局部组织CD34表达降低；与模型组比较，各治疗组较模型组溃疡局部组织CD34表达高，以通心络+干细胞组表达最高。Western-blot检测溃疡局部组织CD105、CD34、CD44蛋白表达：治疗后7d、28d，与对照组比较，模型组CD34、CD44、CD105表达降低（P<0.01）；与模型组比较，各治疗组溃疡局部组织CD34、CD44、CD105表达增加(P<0.05或P<0.01)；与干细胞组比较，通心络+干细胞组CD34、CD44、CD105表达增加（P<0.05或P<0.01）。3通心络胶囊联合外周血干细胞移植治疗对糖尿病足溃疡大鼠氧化损伤及细胞粘附分子的影响各组大鼠血清ROS、AGE、RAGE水平：治疗后7d、28d，与对照组比较，模型组血清ROS、AGE、RAGE增加(P<0.01)；与模型组比较，通心络组和通心络+干细胞组血清ROS、AGE、RAGE含量降低(P<0.05或P<0.01)；与干细胞组比较通心络+干细胞组组血清ROS、AGE、RAGE含量降低(P<0.05或P<0.01)。各组大鼠溃疡组织局部ICAM、VCAM蛋白含量变化：治疗后7d、28d，与对照组比较，模型组溃疡局部组织ICAM-1、VCAM-1表达增加(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组溃疡局部组织ICAM-1、VCAM-1表达降低(P<0.05或P<0.01)；与干细胞组比较，通心络组和通心络+干细胞组溃疡局部组织ICAM-1、VCAM-1表达降低（P<0.05或P<0.01）。各组大鼠溃疡组织局部Nrf-2、HO-1蛋白含量变化：治疗后7d、28d，与模型组比较，各治疗组溃疡局部组织Nrf-2、HO-1表达增加(P<0.05或P<0.01)；与干细胞组比较，通心络组和通心络+干细胞组溃疡局部组织Nrf-2、HO-1表达增加（P<0.05或P<0.01）。各组大鼠溃疡局部组织RAGEmRNA表达变化：治疗后7d、28d，与对照组比较，模型组RAGEmRNA表达升高(P<0.01)；分别与模型组、干细胞组比较，通心络和通心络+干细胞组溃疡局部组织RAGEmRNA表达降低(P<0.05或P<0.01)。结论：1通心络胶囊联合外周血干细胞移植治疗能够显著改善糖尿病足溃疡大鼠一般状态，增加血清胰岛素水平，促进肉芽组织生长，促进溃疡创面的愈合。2通心络胶囊联合外周血干细胞移植可促进血清及溃疡局部组织VEGF表达，促进干细胞分化，促进血管新生。3通心络胶囊联合外周血干细胞移植抑制AGE及其受体表达，抑制氧化应激损伤和粘附分子表达。通心络胶囊联合外周血干细胞移植可从减轻溃疡局部组织氧化炎症损伤，促进干细胞分化，改善局部微环境方面，促进血管新生方面发挥对糖尿病足溃疡的治疗作用，为糖尿病足溃疡的治疗提供了新的方法。