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目的:姜黄(Rhizoma Curcumae Longae)是姜科植物姜黄(Curcumalonga L.)的干燥根茎,主要活性成分为姜黄素(Curcumin)。由于抗氧化和抗炎活性较高,姜黄素被广泛用于肝脏相关疾病的预防和治疗。然而,姜黄素的稳定性、溶解度和生物利用度较差,临床应用价值很低。因此,姜黄素的体内代谢产物如四氢姜黄素(Tetrahy drocurcumin)和八氢姜黄素(Octahydrocurcumin),成为近几年国内外的生物医学研究热点。八氢姜黄素是姜黄素的氢化代谢产物,具有比姜黄素更强的抗炎和抗氧化活性。但是,由于获取困难,未见八氢姜黄素的肝保护作用研究。八氢姜黄素的化学结构中含有2个手性C原子。由于结构对称性,产生了 2个立体异构体,分别是(3R,5S)-octahydrocurcumin(又称 Meso-octahydrocurcumin,Meso-OHC)和(3S,5S)-octahydrocurcumin((3S,5S)-OHC)。然而,姜黄素的体内代谢是否能够产生八氢姜黄素立体异构体未见报道。当立体异构体作用于人体的手性环境时,其立体结构在生物体内引起不同酶系的分子识别造成“手性识别”现象,从而产生不同的药效。但是,关于八氢姜黄素的2个立体异构体,是否能在生物体内引起“酶系识别”作用,从而产生差异性的药理活性未见报道。本文首先采用对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)诱导的小鼠急性肝损伤模型,探讨八氢姜黄素的肝保护作用及相关机制;通过高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测大鼠灌胃姜黄素之后不同代谢样品,确认八氢姜黄素立体异构体是否存在;采用快速柱层析结合萃取法制备Meso-OHC和(3S,5S)-OHC纯品,用于后续动物实验;采用制备液相法制备Meso-OHC和(3S,5S)-OHC单体,用于后续化学结构鉴定和细胞实验;采用“Cocktail”探针药物法研究Meso-OHC和(3S,5S)-OHC对L-02细胞的药物代谢酶影响,以探讨立体异构体是否会引起“酶系识别”作用;采用APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型研究Meso-OHC和(3S,5S)-OHC的肝保护作用及相关机制,以探讨立体异构体间的差异性药理活性。方法和结果:1.八氢姜黄素抗APAP诱导的急性肝损伤的作用及机制研究采用APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型研究八氢姜黄素的肝保护作用,并以姜黄素和四氢姜黄素为参考,确认其作用强度。实验过程中,测定下述指标以探讨八氢姜黄素的作用及机制:测定ALT和AST活性;制备H&E病理切片;测定肝组织中GSH、SOD、CAT、T-AOC、MDA和ROS水平;体外肝微粒体孵育法测定CYP2E1酶活性;RT-PCR 法测定 CYP2E1、GCLC、GCLM、NQO1 和 HO-1 的 mRNA 表达;Western blot法检测CYP2E1、GCLC、GCLM、NQO1和HO-1的总蛋白、胞浆Keap1和核内外Nrf2蛋白的表达;分子对接探讨八氢姜黄素与CYP2E1酶和Keap1蛋白之间的结合机制。实验结果表明,八氢姜黄素(25,50和100 mg/kg)具有良好的抗APAP肝损伤作用,且呈剂量依赖性。八氢姜黄素可显著改善小鼠肝功能(ALT和AST)及肝脏组织病理状态,并且作用强度优于姜黄素和四氢姜黄素。八氢姜黄素抗APAP肝损伤的主要作用机制为:改善肝脏氧化应激状态(提高GSH、SOD、CAT和T-AOC水平,降低MDA和ROS水平);与CYP2E1酶结合并抑制其活性和表达;与Keap1蛋白结合,抑制Keap1蛋白的表达,继而促进Nrf2蛋白核转位,最终激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路;诱导Keap1-Nrf2抗氧化应激通路下游目的基因(GCLC、GCLM、NQO1和HO-1)的表达。2.姜黄素大鼠体内代谢研究以大鼠为研究对象,收集大鼠灌胃姜黄素(100 mg/kg)后的血液、肝脏、尿液和粪便样品。采用HPLC法分析代谢样品中是否存在八氢姜黄素立体异构体。实验结果表明,大鼠灌胃姜黄素后,其血液、肝脏、尿液和粪便样品中均可检测出八氢姜黄素立体异构体(M1和M2,其中M2极性较大)。此外,2种立体异构体在不同样品中的分布比例有所不同:血液中M2:M1=0.34:1;肝脏中M2:M1=0.73:1;尿液中 M2:M1=4.59:1;粪便中 M2:M1=0.81:1。3.八氢姜黄素立体异构体拆分制备和结构鉴定采用快速柱层析结合萃取法制备M1和M2的纯品,为动物实验提供药物储备;采用制备液相法制备M1和M2的单体,为化学结构鉴定和细胞实验提供药物储备;采用液相质谱(Liquid mass spectrometry,LC-MS)、核磁共振氢谱与碳谱(Nuclear paramagnetic resonance spectroscopy,NMR)、比旋光度以及X-射线单晶衍射法确定M1和M2的绝对构型。采用快速柱层析结合萃取法获得M1和M2的纯品,纯度均大于95%;经制备液相纯化后获得M1和M2的单体,纯度大于98%。经LC-MS和1H-NMR检测分析后,M1和M2的结构数据基本一致,均符合八氢姜黄素相关文献记录,确认两者均为八氢姜黄素。经13C-NMR和比旋度检测分析,确认M1和M2分别为Meso-OHC和(3S,5S)-OHC,符合相关文献记录。此外,采用溶剂扩散法首次制备出了 M1单晶,经X-射线单晶衍射法检测分析后,确认M1的绝对构型为Meso型。4.八氢姜黄素立体异构体对L-02细胞药物代谢酶的作用研究采用“Cocktail”探针药物法结合分子对接,评价Meso-OHC和(3S,5S)-OHC对L-02 的药物代谢酶(CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C8、CYP2E1 和 UGTs)活性影响及相关机制;采用RT-PCR法,测定Meso-OHC和(3S,5S)-OHC对CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C8、CYP2E1 和 UGTs 酶 mRNA水平的影响。实验结果表明,6.25、12.5、25、50、100 和 200μM 剂量下,Meso-OHC 和(3S,5S)-OHC对L-02细胞活力无影响,可用作后续细胞实验剂量。6.25～100μM剂量下,Meso-OHC和(3S,5S)-OHC对L-02细胞的大部分药物代谢酶(CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C8和UGTs)的活性或者表达无显著影响,表明其潜在的药物与药物之间相互作用(Drug-drug interaction,DDI)风险较低。此外,Meso-OHC 和(3S,5S)-OHC均可以抑制CYP2E1酶的活性和表达,并且Meso-OHC的作用强度显著优于(3S,5S)-OHC。以上结果表明,CYP2E1酶对Meso-OHC和(3S,5S)-OHC具有选择性识别作用。分子对接进一步表明,Meso-OHC和(3S,5S)-OHC均可与CYP2E1酶活性部位结合,但结合部位和结合能有所不同。5.八氢姜黄素立体异构体抗APAP诱导的急性肝损伤作用和机制研究采用APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型研究Meso-OHC和(3S,5S)-OHC的肝保护作用和机制。实验过程中,测定下述指标以探讨Meso-OHC和(3S,5S)-OHC的作用和机制:测定ALT和AST活性;制备H&E病理切片;测定GSH、SOD、CAT、T-AOC和MDA水平;免疫组化法测定3-NT和4-HNE的表达;Elisa法测定CYP2E1和UGT1A1 酶活性、TNF-α 和 IL-1β水平;RT-PCR 测定 CYP2E1、UGT1A1、TNF-α、IL-1β、GCLC、GCLM、NQO1 和 HO-1 的基因表达;Western blot 法检测 CYP2E1、UGT1A1、IκBα、p-IκBα、GCLC、GCLM、NQO1 和 HO-1 的总蛋白表达,胞浆 Keap1、核内外p65和Nrf2蛋白表达;分子对接法研究八氢姜黄素立体异构体与p65蛋白和Keap1蛋白之间的结合机制。实验结果表明,Meso-OHC和(3S,5S)-OHC(25,50和100mg/kg)具有良好的抗APAP肝损伤作用,且呈剂量依赖性。Meso-OHC和(3S,5S)-OHC均可显著改善小鼠肝功能(ALT和AST)及肝脏组织病理状态,并且Meso-OHC的作用强度优于(3S,5S)-OHC。Meso-OHC和(3S,5S)-OHC的肝保护主要作用机制为:改善肝脏氧化应激状态(提高GSH、SOD、CAT和T-AOC水平,降低MDA、3-NT和4-HNE的水平);抑制CYP2E1酶活性和表达;诱导UGT1A1酶活性和表达;与Keap1蛋白结合,抑制Keap1蛋白的表达,进而促进Nrf2核转位,最终激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路;诱导Keap1-Nrf2抗氧化应激通路下游目的基因(GCLC、GCLM、NQO1和HO-1)的表达;与p65蛋白结合,抑制IκBα向p-IκBα的转化,进而抑制p65蛋白核转位,最终抑制NFκB(p65)炎症通路的活化;抑制NFκB(p65)炎症通路下游目的基因(TNF-α和IL-1β)的表达。此外,两者作用机制存在一定差异:Meso-OHC激活Keap1-Nrf2通路的作用强度优于(3S,5S)-OHC,(3S,5S)-OHC抑制NFκB(p65)炎症通路的作用强度优于Meso-OHC。结论:本文的研究结果首次证实了八氢姜黄素具有良好的抗APAP诱导的肝损伤作用,主要机制为抑制CYP2E1酶和激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路。姜黄素的体内代谢可以产生八氢姜黄素立体异构体,并且2种八氢姜黄素立体异构体在不同的代谢部位(血液、肝脏、尿液和粪便)中的分布状况有所不同。CYP2E1酶对八氢姜黄素立体异构体具有选择性识别作用,主要机制为结合能和结合位点不同。八氢姜黄素立体异构体具有抗APAP诱导的肝损伤作用,主要机制为抑制CYP2E1酶、激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路、抑制NFκB(p65)炎症通路的活化。此外,八氢姜黄素立体异构体在APAP诱导的肝损伤模型中,存在差异性的肝保护行为:Meso-OHC对小鼠肝功能的改善作用优于(3S,5S)-OHC;Meso-OHC激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路的作用强度优于(3S,5S)-OHC;(3S,5S)-OHC抑制NFκB(p65)炎症通路的作用强度优于Meso-OHC。