本研究通过高Met和B族维生素添加或缺乏的膳食干预来促进小鼠AS形成不同的动物模型，以研究血浆Hcy和SAH对apoE基因缺陷小鼠AS形成的影响，并对SAH促进．AS形成或引起血管损伤的可能作用机制进行了探讨。 研究方法: 1.同型半胱氨酸对apoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化形成的影响 (1)动物分组、膳食干预及处理将60只断乳后的apoE基因缺陷小鼠，喂饲正常饲料到达8周鼠龄后按体重随机分成5组：①对照组(Control)；⑦高Met组(M+)；⑦高Met维生素B缺乏组(M+B-)；④高Met维生素B添加组(M+B+)；⑤维生素B缺乏组(B-组)，每组小鼠雌雄各半。对照组饲以．AIN-93G饲料，高Met组在对照组的基础上添加Met。饲料配方采用不含维生素的酪蛋白，不同实验组选用不同的维生素混合物，其中B族维生素干预组采用不含维生素B12、维生素B6和叶酸的维生素混合物，并在此基础上分别给予不同含量的添加以精确三种B族维生素的摄入量。将各组实验小鼠按组别分笼喂养，自由饮水摄食，动物房室内温度控制在24℃左右。每周称体重一次，记录各组动物的摄食量，总共进行8周膳食干预。 实验结束后，小鼠经眼眶静脉采血后颈椎脱臼处死。采集的新鲜血液分别离心收集血清和血浆，分装保存于-20℃待测；各组实验小鼠的心、肝、脾、肺、肾用于脏器系数评价；取小鼠新鲜心脏，10％福尔马林中保存，主动脉窦用于AS斑块面积分析；小鼠主动脉分为两段，-80℃冻存。 (2)膳食高Met和B族维生素干预对apoE基因缺陷小鼠血浆tHey水平的影响采用直接竞争免疫光化学法测定血清叶酸、维生素B12含量；高效液相色谱法检测血清维生素B6含量；荧光偏振免疫分析(fluorescence polarizationimmunoassay，FPIA)法检测血浆中tHey的含量。 (3)ApoE基因缺陷小鼠AS斑块面积分析取小鼠新鲜心脏，冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干多余液体后立即放入10％福尔马林中保存。冰冻切片时，首先包埋心脏组织，主动脉窦远端的辨认是以心脏和主动脉连接处的三尖瓣为依据，每间隔10 μm制作1张10μm的切片，每张切片上放4片组织，每只小鼠制作4张切片。主动脉窦冰冻切片采用油红O染色法,全自动图像分析系统分析各实验组小鼠主动脉窦AS斑块面积以及主动脉窦的管腔面积，以小鼠AS斑块面积／管腔面积比值的平均值来表示各实验组小鼠AS斑块的大小。 2.S-腺苷同型半胱氨酸在高蛋氨酸促apoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化形成中的作用及其机制探讨(1)小鼠血浆SAH含量检测方法的建立将标准品稀释成适当浓度，按0，9：1，10：1，11：1，12：1加入三氯乙酸，冰浴30分钟后，18000 rpm离心10 min。取上清加等量NaOH中和酸，定容后测定，确定样品最适比例沉淀蛋白。 分别取出5份相同体积的样品和标准品，同一条件下按实验方法进行重复试验，检验此方法的稳定性，然后确定最低检测限及回收率。 具体操作步骤：所有的溶液及微孔板条室温过夜，自动微孔板摇床保证混合均匀。将标准品适当稀释分别加入对照血浆，使其终浓度为5，10，20，40，80，100，120 nM，将加标准品的对照血浆和标本血浆按11：1的比例加入三氯乙酸沉淀蛋白，震荡混合后，冰浴30 min。18000 rpm离心10分钟后，取上清加等量NaOH中和，定容。将处理好的标准品和标本各25μL于SAH包被好的微孔板条相应孔中，加入200μL抗-SAH抗体，18-25℃温育30 min，用封胶纸密封。1×稀释的洗涤液350μL洗板4次，扣干。加100μL酶结合物于各孔中，18-25℃温育20 min。1×稀释的洗涤液350μL洗板4次，扣干。加100μL底物溶液于各孔中，18-25℃温育10 min。最后加100μL终止液于各孔中，摇床摇匀，15 min内于450 nm处读取吸光值。以标准品吸光值为纵坐标，相应的浓度为横坐标绘制标准曲线，吸光值与SAH浓度成反比。 (2)．ApoE基因缺陷小鼠主动脉DNA甲基转移酶的表达及其活性的变化1)小鼠主动脉Dnmt 3a和Dnmt 3b mRNA的表达：提取小鼠主动脉总RNA并进行纯度鉴定。逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerasechain reaction，RT-PCR)测定Dnmt 3a和Dnmt 3b的mRNA表达量。 2)小鼠主动脉Dnmt 1的mRNA和蛋白表达变化：提取的小鼠主动脉总RNA采用RT-PCR法检测Dnmt 1的mRNA的表达量；提取小鼠主动脉总蛋白，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后采用免疫印迹法(Western blot)测定小鼠主动脉Dnmt 1蛋白的表达量。 3)小鼠主动脉总体Dnmt活性的改变：提取小鼠主动脉核蛋白用以检测Dnmt的活性。采用稳定的包被有胞嘧啶DNA的微孔板，Dnmt将SAM的甲基转移给富含胞嘧啶的DNA底物，甲基化的DNA可被5-甲基胞嘧啶抗体识别，结合色谱法的ELISA类似方法检测甲基化的DNA比值。结果以37℃每小时内每毫克蛋白催化生成的5-甲基胞嘧啶在540 nm处的吸光度来表示Dnmt的活性。 (3)ApoE基因缺陷小鼠主动脉DNA整体甲基化水平的变化提取小鼠主动脉DNA，统一样品浓度调整至40mg／L。DNA整体甲基化的检测采用高度亲和DNA的微孔板，使DNA固定在微孔中，甲基化的DNA片段能被5-甲基胞嘧啶抗体识别并通过ELISA类似反应进行定量分析，甲基化的DNA可通过OD强度的比例来反应。 结论: 1.高Met膳食引起的血管损伤或血管AS病变是不依赖Hcy的，Hcy不是引起血管损伤或AS病变的关键或直接的致病因素，Hcy是AS独立危险性因素的假说不能成立。 2. ApoE基因缺陷小鼠AS斑块面积与其血浆SAH水平呈正相关关系，表明血浆SAH是一个比血浆Hcy更好的反映血管损伤或血管AS病变的生物标志物。 3. ApoE基因缺陷小鼠主动脉Dnmt活性和DNA整体甲基化水平分别与其血浆SAH水平呈负相关，提示血浆SAH促AS形成或血管损伤的致病机制可能与抑制了组织Dnmt活性进而导致DNA甲基化水平改变相关。