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第一部分参附注射液通过抑制JNK/Nox4和JNK/NFκB途径来保护棕榈酸诱导的肝AML12细胞损伤目的:非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)包括脂肪变性、肝炎、肝细胞损伤和纤维化。在本研究中,我们拟探讨一种传统中药-参附注射液(Shen Fu preparation,SF)在体外肝脂肪变性模型中的保护作用和潜在机制。方法:建立棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导鼠肝细胞损伤模拟离体NASH模型,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定法(Terminal dexynucleotidyl transferase(Td T)-mediated d UTP nick-end labeling,TUNEL)和甘油三酯比色测定法(TG Colorimetric Assay)对细胞凋亡和细胞内甘油三酯水平(Intracellular triglyceride,i TG)进行评估;分别采用DCF(Dichlorofluorescein,二氯荧光素)和JC-1(5,5‘,6,6’-四氯-1,1‘,3,3’-四乙基苯酸盐-咪唑羰基花青素)测定活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)水平;使用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)评估细胞因子水平;用免疫印迹法(Immunoblot)检测JNK(C-Jun N-terminal kinase,c-Jun氨基末端激酶)、Nox4(NADPH oxidase 4,NADPH氧化酶4)和NFκB(Nuclear factor kappa B,核因子kappa B)的表达变化。结果:参附注射液减轻了棕榈酸诱导的细胞凋亡,以及降低了IL-6(白细胞介素-6)、IL-8(白细胞介素-8)和i TG的表达。经过棕榈酸处理的细胞中,添加参附注射液,可以降低Nox4和ROS的水平,同时MMP、Mn SOD(锰超氧化物歧化酶)和过氧化氢酶的表达升高,表明线粒体功能障碍的发生。应用Nox4抑制剂-GKT137381抑制了由棕榈酸诱导产生的ROS和细胞凋亡的增加,同时降低了i TG的量,但并没有影响IL-8和IL-6的水平。参附注射液可以抑制棕榈酸诱导的磷酸化氨基末端激酶的上调。JNK抑制剂-SP600125抑制了由棕榈酸诱导的Nox4、IL-8、IL-6和i TG的增加。应用参附注射液后,可以阻断棕榈酸处理过的细胞中检测到的NFκB/p65核转位。BAY11-7082,一种IκB(Inhibitor of NF-κB)降解抑制剂,降低了由棕榈酸诱导的IL-8、IL-6以及i TG的量,而它只是轻微地降低了ROS含量,对细胞凋亡没有影响。结论:参附注射液通过减少氧化应激和细胞因子的产生以及抑制JNK/Nox4和JNK/NFκB途径,在预防肝细胞损伤过程中发挥了至关重要的作用。第二部分参附注射液能显著改善脂多糖诱导的肠道上皮细胞损伤目的:肠道上皮细胞在肠道屏障功能的维护中起着至关重要的作用,而潜在的损伤机制还没有完全阐明。本研究拟对一种传统中药-参附注射液(Shen Fu preparation,SF)在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的肠道上皮细胞损伤中的保护作用和分子机制进行系统探讨。方法:采用HIEC-6细胞(Human intestinal epithelial cell,人肠上皮细胞系),单独应用LPS或LPS与SF联合应用来进行实验。应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定法(Terminal dexynucleotidyl transferase(Td T)-mediated d UTP nick-end labeling,TUNEL)对细胞凋亡进行评估。活性氧(ROS)水平是用DCF(Dichlorofluorescein,二氯荧光素)测定法测定的。经transwell培养板培养的单层人肠上皮细胞-6,通过FITC-albumin influx assay分析其渗透性。应用即时聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)来对细胞因子IL-1β(白介素-1β)、IL-6(白介素-6)和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)进行定量分析。蛋白质印迹法(Western blot)用于测定胞浆IκBα(核因子κB抑制因子α)和核NFκB/p65亚基的含量。结果:在脂多糖处理的细胞中发现了细胞凋亡、ROS和细胞因子的产生,以及NFκB/p65的核转位。DPI(二碘基苯)是一种特殊的ROS抑制剂,可减轻脂多糖诱导的细胞凋亡、细胞因子的产生和NFκB/p65核转位。BAY11-7082是一种IκB降解抑制剂,可以消除脂多糖诱导的细胞因子过剩。最有趣的是,参附注射液阻止了脂多糖诱导的细胞胞浆IκBα的降解,导致NFκB/p65的核分数降低。参附注射液剂量依赖性地抑制细胞凋亡的增加、ROS的产生和脂多糖诱导的细胞的渗透性。此外,参附注射液阻止了脂多糖介导的TNF-α和IL-6过度产生。结论:参附注射液通过抑制ROS的产生和NFκB/p65核转位,进而导致炎性细胞因子的减少,来保护由脂多糖诱导的肠道上皮细胞损伤。