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肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起学龄前尤其是5岁以下儿童手足口病最常见的致病病毒,临床上可引起严重的中枢神经系统疾病,目前其致病机制尚不清。EV71主要经粪口途径传播,口咽是病毒侵入人体的初始部位,但EV71感染侵入人体的靶器官或靶细胞目前仍不明确,研究报道在EV71感染儿童尸检扁桃体隐窝上皮中检测到EV71抗原和RNA,而在胃肠道的其他部位并未检出,我们推测扁桃体隐窝上皮细胞可能是EV71感染侵入人体且支持EV71复制的靶细胞。目前关于EV71感染人扁桃体隐窝上皮细胞相关方面的研究和报道甚少,因此,本研究将从以下三部分进行研究:一、人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定【目的】建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。【方法】收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和II型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶-EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用倒置相差显微镜观察细胞形态和生长特点;免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。【结果】II型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法(P<0.05)。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定隐窝上皮特异性角蛋白Cytokeratin 8/18染色阳性。【结论】应用II型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶-EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。二、EV71感染人扁桃体隐窝上皮细胞模型的建立【目的】建立EV71感染人扁桃体隐窝上皮细胞体外模型。【方法】用EV71病毒感染人扁桃体隐窝上皮细胞,分别设立正常对照组及EV71感染组,在倒置相差显微镜下观察正常对照组及EV71感染后不同时间点(12h、24h、36h、48h)细胞病变情况;用Real-time PCR方法扩增EV71核酸片段,采用Western Blot方法检测EV71蛋白的表达情况,采用免疫荧光技术检测EV71病毒在扁桃体隐窝上皮细胞的表达情况以及表达部位。【结果】EV71感染人扁桃体隐窝上皮细胞后,细胞出现明显的病变效应,随着感染时间的延长,EV71病毒核酸及蛋白的表达不断增多,主要定位于细胞质,并且能够组装形成新的病毒颗粒。【结论】原代培养的人扁桃体隐窝上皮细胞支持EV71的增殖,是EV71的敏感靶细胞,成功建立EV71感染人扁桃体隐窝上皮细胞体外模型。三、EV71感染人扁桃体隐窝上皮细胞免疫反应的研究【目的】探讨EV71感染人扁桃体隐窝上皮细胞免疫反应。【方法】用EV71病毒感染人扁桃体隐窝上皮细胞,分别设立正常对照组及EV71感染组,用trizol分别提取两组细胞不同时间点(12h、24h、36h)的细胞RNA,进行RNA浓度、纯度及完整性检测,逆转录构建cDNA文库,进行转录组测序,将同一时间点的EV71感染扁桃体隐窝上皮细胞组测序结果与正常对照组测序结果进行比较分析,将差异表达基因进行KEGG Pathway功能富集,并比较EV71感染人扁桃体隐窝上皮细胞后免疫相关差异表达基因。【结果】转录组测序结果表明EV71感染人扁桃体隐窝上皮细胞后模式识别受体TLRs通路(MyD88、TRIF、TRAF6等)、RLRs通路(RIG-I、MDA5等)、NLRs通路(NLRP1等)均表达上调,补体系统中C3、CD59等表达明显升高,细胞因子中前炎症因子(IL-6、IL-1β等)以及各种趋化因子(CXCL8、CXCL10等)表达上调非常明显,细胞内促凋亡因子(Caspase、APAF1、FLIP等)及抗凋亡因子(BIRC3等)表达均升高,大量抗病毒因子(IFITMs、OAS1、MXs、ISGs等)上调明显。【结论】EV71感染人扁桃体隐窝上皮细胞可通过模式识别受体激活强烈的免疫应答,分泌大量细胞因子和抗病毒因子,且扁桃体隐窝上皮细胞存在凋亡和抗凋亡的博弈现象。