丝素/海藻酸钠支架材料促进受损皮肤毛囊结构再生的研究

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传统的支架材料在皮肤修复方面已经取得了突破性的进展,组织工程皮肤修复材料日益实现商业化。但是真皮层中的毛囊等附属器官的再生仍然没有成熟的理论作为支撑,大多数的材料还处于探索阶段。本课题采用毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)作为种子细胞与生物相容性良好的复合支架建立组织工程皮肤修复材料,探究对毛囊结构再生的影响。利用单细胞系和简单的材料体系为毛囊再生提供新的解决方案,丰富了软组织功能化修复的生物材料体系。为了保证DPCs的活性,通过机械解剖和胶原酶消化相结合的方法,从SD大鼠触须处提取了细胞。免疫荧光染色结果表明,所提取的细胞具有α-SMA特征蛋白强阳性表达、CK-19蛋白阴性表达的特征。结合鬼笔环肽细胞微丝染色呈现的长梭形和聚集态生长特点,证明了自提取细胞符合体外培养的DPCs的生长特性。模拟体内组织或细胞生长所处的细胞外基质微环境的结构能够更好促进细胞粘附和生长,采用相容性良好的丝素蛋白(Silk Fibroin,SF)和海藻酸钠(Sodium Alginate,SA)制备多孔的支架材料。通过对纯SF支架、纯SA支架和SF/SA复合支架的SEM扫描发现,SF与SA的复合反应能够使孔径分布稳定在173.35±20.259μm,并拥有适中的孔隙率72.845±1.537%,在主孔洞的壁上分布着小的副孔洞,为细胞的迁移和营养物质运输创造了条件。XRD和DSC分析表明SF/SA的复合提高两种原材料的相容性。良好的生物相容性是材料用于体内评价的基础。我们使用材料浸提液来培养DPCs探究对细胞的毒性和形态影响。CCK-8和Calcein-AM/PI活/死细胞染色结果显示,DPCs在复合支架浸提液中生长良好,但是SF支架浸提液对细胞有严重的毒性,细胞无法正常生长。培养3天的鬼笔环肽染色结果显示,复合支架组细胞形态和聚集生长特征保持正常,SF组细胞数量很少,细胞形态呈菱形,生长已无聚集性。这些结果说明SF/SA复合支架具有良好的细胞相容性,而SF组支架不能用于进一步的体内评价。其次,我们将DPCs接种到不同支架中,通过DAPI细胞核和支架石蜡切片染色检测细胞在支架上的生长行为。结果表明DPCs主要粘附于孔洞壁上,且复合支架组上能清楚的看到细胞聚集成团,这说明复合支架对DPCs的生长无抑制作用,而且维持了DPCs诱导毛囊再生的能力。最终我们将复合支架材料植入大鼠背部创面进行体内毛囊再生评价。接种有DPCs的支架表现出更好的促皮肤修复作用。新生组织的H&E染色图中能看到大量的毛囊、皮脂腺等附属器官。RT-qPCR和Wb特征因子和蛋白结果显示接种DPCs的支架组具有高表达的β-catenin、ALP和Versican特征因子,CD31、ALP、β-catenin的蛋白印迹条带宽度和深度大。表明接种DPCs支架具有促进创伤修复,诱导毛囊再生的能力。
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