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罗非鱼隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)，是我国重要养殖鱼类之一。近年广东、海南、福建和广西等地区养殖罗非鱼爆发链球病，使我国罗非鱼养殖业的健康发展受到了严重威胁，因此提高罗非鱼的抗病能力成为迫切需要解决的问题。转基因技术为鱼类育种开辟了新的途径。本研究通过比较、筛选出对无乳链球菌具有较强溶菌作用的罗非鱼Lysozyme-C3基因，利用本实验室已分离到的诱导型罗非鱼Hsp70基因启动子，构建了罗非鱼Lysozyme-C3基因表达载体并进行显微注射，观察转植基因在斑马鱼中的表达情况，为转基因培育抗病罗非鱼的研究奠定基础。主要研究内容如下：1．几种鱼虾溶菌酶重组蛋白溶菌活性的比较。采用基因工程重组技术制备了罗非鱼3种C型溶菌酶的重组蛋白，并应用比浊法比较了它们与草鱼C型、G型溶菌酶、斑节对虾C型溶菌酶重组蛋白对无乳链球菌、嗜水气单胞菌等8种细菌的溶菌作用。结果显示6种重组溶菌酶对8种菌均具有溶菌活性，但是溶菌活力强弱不一。罗非鱼C3溶菌酶对革兰氏阳性菌无乳链球菌的溶菌作用最强，草鱼C型与G型溶菌酶次之；所有重组溶菌酶对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌均具较强的溶菌活性。与斑节对虾C型溶菌酶、草鱼C型与G型溶菌酶相比，罗非鱼的C型溶菌酶对嗜水气单胞菌具有较强的溶菌作用，且以C1的溶菌活性最强。2．应用金鱼Tgf2转座酶系统进行Lysozyme-C3基因的转植研究。金鱼Tgf2转座子是近年在金鱼上发现的具有转座活性的转座子。本实验室前期研究中，构建了带罗非鱼Hsp70启动子的转座子供体质粒pTgf2-Hsp70-eGFP并证实该启动子具有强诱导活性。本实验利用高保真酶PCR扩增罗非鱼Lysozyme-C3基因开放阅读框并替换该供体质粒中的eGFP基因，获得pTgf2-Hsp70-C3表达载体。然后设计引物扩增此载体上的Hsp70-C3-SV40片段，并将其插入pTgf2-Hsp70-eGFP载体的eGFP之后，从而成功构建了用于斑马鱼转基因的双基因表达载体pTgf2-Hsp70-eGFP-Hsp70-C3。3．转Lysozyme-C3基因斑马鱼的获得与检测。采用显微注射方法将携带Hsp70启动子、eGFP基因和C3基因的转座子供体质粒pTgf2-Hsp70-eGFP-Hsp70-C3和编码转座酶的mRNA共注射到斑马鱼的受精卵中。注射12h后37℃热激处理1h，28℃孵育，12h后使用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光表达情况，并挑选出呈绿色荧光的斑马鱼阳性个体。共有580个胚胎孵化出膜，其中有261个胚胎有绿色荧光，荧光率达45%。采用RT-PCR在转基因斑马鱼F1代肝脏、肌肉、肠道、皮肤中均可检测到eGFP基因mRNA，但仅在肝脏中检测到Lysozyme-C3基因mRNA。采用Western blot技术在转基因斑马鱼F1代肝脏中均可检测到eGFP和Lysozyme-C3蛋白条带。分析结果说明，在RNA水平和蛋白水平均能检测到转植基因的表达，证实转植的罗非鱼溶菌酶基因通过转基因首代遗传到F1代。进一步比较野生型和转基因斑马鱼F1代肌肉和肝脏溶菌酶对无乳链球菌的溶菌活性，发现转基因斑马鱼具有较强的溶菌活性，提示转基因斑马鱼可能比野生型斑马鱼具有更强的抵御无乳链球菌感染的能力。本研究结果为下一步开展转基因培育抗病罗非鱼的研究奠定了基础。