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第一部分:NNMT的表达与鼻咽癌临床病理特征及其预后的相关性目的:分析和检测正常鼻咽组织和鼻咽癌组织中NNMT的表达差异,研究NNMT表达与鼻咽癌患者临床病理特征的关系及预后分析。方法:通过公共数据库GEO数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）对正常鼻咽组织和鼻咽癌组织中NNMT的表达差异进行分析,同时分析NNMT在鼻咽癌放射敏感细胞系和放射抵抗细胞系中的表达差异。由于GEO数据库中的鼻咽癌患者样本量较小,存在局限性,而TCGA数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中缺乏单独的鼻咽癌患者数据集,因此对TCGA数据库中的头颈鳞癌患者的NNMT表达及对患者预后影响的数据进行分析。将收集到的临床组织标本进行免疫组化染色,验证NNMT的表达差异及其与鼻咽癌患者临床病理特征的关系和预后相关性。结果:分析数据集GSE12452的数据,结果提示NNMT在鼻咽癌组织中的表达量显著高于正常鼻咽组织。分析数据集GSE48503的数据,结果发现NNMT在鼻咽癌放射抵抗细胞系中表达量显著高于放射敏感细胞系。TCGA数据库的分析提示,在头颈鳞癌的患者中,与NNMT低表达的患者相比,NNMT高表达的患者预后较差。进一步收集了134例鼻咽癌患者和15例良性鼻咽病变的临床组织样本,根据NNMT免疫组化染色的结果分析证实,NNMT的高低表达与鼻咽癌患者的性别、N分期、M分期、组织学类型和是否有EB病毒感染情况无关,而与患者的年龄（P=0.022）、T分期（P=0.000）和临床分期（P=0.005）具有显著相关性。Kaplan-Meier分析鼻咽癌患者的预后情况发现,与NNMT低表达的患者相比,NNMT高表达的鼻咽癌患者的总体生存率相对较低（P=0.043）,结果提示NNMT高表达与鼻咽癌患者的不良预后具有相关性。同时,研究发现,NNMT的高表达与鼻咽癌患者的无进展生存率无显著相关性。结论:NNMT在鼻咽癌组织中高表达,与鼻咽癌患者的不良预后具有相关性。第二部分:NNMT的表达与鼻咽癌细胞生物学行为的关系研究目的:探索NNMT的表达对鼻咽癌细胞生物学行为的影响。方法:给予鼻咽癌细胞系6 Gy剂量的射线照射,通过Western blot和q RT-PCR实验检测照射后不同时间点NNMT的表达情况。给予CNE2细胞持续照射构建获得性放射抵抗细胞系CNE2R,并进行放射抗性验证。通过慢病毒转染的方法构建稳定过表达和敲低NNMT的鼻咽癌细胞系。通过CCK8实验和克隆形成实验检测NNMT的表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。通过Transwell侵袭实验和划痕实验检测NNMT的表达对鼻咽癌细胞侵袭和迁移能力的影响。通过Western blot实验、q RT-PCR实验和免疫荧光实验检测NNMT对鼻咽癌细胞上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）的调控。结果:通过Western blot和q RT-PCR实验发现CNE1、CNE2、HONE1和HNE1细胞经过6 Gy射线照射后,NNMT的表达量明显增高,照射后24 h的表达量增高最明显。克隆形成实验证实CNE2R细胞相对于CNE2细胞具有较强的放射抗性。Western blot和q RT-PCR实验结果表明,放射抵抗CNE2R细胞相对于亲本CNE2细胞,NNMT表达量较高,并且,给予6 Gy照射后,也得到相同的实验结果。相对于CNE2细胞,CNE2R细胞中的E-cadherin表达减少,N-cadherin和Vimentin表达增多,反映DNA双链断裂的蛋白γ-H2AX表达减少。通过CCK8实验和克隆形成实验证实,NNMT过表达后,CNE1和CNE2细胞的增殖能力明显增强,差异均具有统计学意义。NNMT敲减后,HONE1和CNE2R细胞的增殖能力明显减弱,差异均具有统计学意义。Tranwell侵袭实验和划痕实验结果表明,NNMT过表达使CNE1和CNE2细胞的侵袭及迁移能力明显增强,NNMT敲减使HONE1和CNE2R细胞的侵袭及迁移能力明显减弱。Western blot、q RT-PCR和免疫荧光实验结果证明,NNMT过表达可以促进鼻咽癌细胞的EMT形成,而NNMT敲减可以逆转鼻咽癌细胞的EMT形成。结论:NNMT可以调控鼻咽癌细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化。第三部分:NNMT的表达在体内外与鼻咽癌细胞放射抵抗的关系研究目的:体内外实验探索NNMT的表达对鼻咽癌细胞放射抵抗的影响。方法:通过克隆形成实验检测NNMT对鼻咽癌细胞系放射敏感性的影响。通过流式细胞术检测NNMT表达对鼻咽癌细胞系照射后的凋亡率和细胞周期分布的影响。通过Western blot实验和免疫荧光实验探究NNMT的表达对放射线所致鼻咽癌细胞系DNA损伤的影响。最后,通过小鼠皮下移植瘤实验进行体内验证NNMT与鼻咽癌细胞系放射敏感性的关系。结果:克隆形成实验证实,过表达NNMT后,鼻咽癌细胞系的放射敏感性减弱;沉默NNMT后,鼻咽癌细胞系的放射敏感性增强。细胞凋亡实验证实,NNMT过表达联合6 Gy照射处理CNE1和CNE2细胞后,CNE1和CNE2细胞的凋亡率明显下降,差异具有统计学意义。NNMT敲低联合6 Gy照射处理HONE1和CNE2R细胞后,HONE1和CNE2R细胞的凋亡率明显升高,差异具有统计学意义。细胞周期实验发现,6 Gy照射后,鼻咽癌细胞出现G2/M期阻滞,而过表达NNMT可以抑制鼻咽癌细胞的G2/M期阻滞情况,差异具有统计学意义。反之,沉默NNMT可以促进鼻咽癌细胞的G2/M期阻滞情况。Western blot实验和免疫荧光实验的结果表明,6 Gy剂量射线照射后,过表达NNMT的鼻咽癌细胞中的γ-H2AX表达量下降。与之相反,6 Gy剂量射线照射后,沉默NNMT的鼻咽癌细胞中的γ-H2AX表达量升高。皮下移植瘤实验证实,照射组（Ionizing Radiation,IR）肿瘤体积明显小于未照射组且肿瘤生长缓慢,NNMT沉默组肿瘤体积也明显小于对照组且肿瘤生长缓慢。结论:NNMT在体内外可以通过调控细胞凋亡、G2/M期阻滞和DNA双链断裂调节鼻咽癌细胞的放射敏感性。第四部分:NNMT通过与β-catenin结合调控Wnt/β-catenin信号通路目的:探索NNMT调控鼻咽癌细胞生物学行为和放射敏感性的作用机制。方法:通过Western blot实验验证干扰NNMT表达后β-catenin下游靶基因是否激活。CNE1和CNE2细胞共转染NNMT过表达和β-catenin敲减的慢病毒,通过CCK8实验、Transwell侵袭实验、划痕实验和Western blot实验进行细胞回复实验。通过Western blot实验和免疫共沉淀实验验证NNMT与β-catenin的相互作用。结果:Western blot实验结果发现,NNMT过表达后,CNE1和CNE2细胞中的β-catenin表达量上调,下游靶基因C-myc,Cyclin D1和GSK-3β的蛋白表达量也上调。NNMT敲减后,HONE1和CNE2R细胞中的β-catenin表达量下调,下游靶基因C-myc,Cyclin D1和GSK-3β的蛋白表达量也下调。沉默β-catenin可以逆转过表达NNMT导致的鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移能力增强,也可以逆转NNMT过表达导致的EMT。在CNE1和CNE2细胞中,NNMT能和β-catenin直接结合,在HONE1和CNE2R细胞中,沉默NNMT后,β-catenin的泛素化水平增加。结论:NNMT通过与β-catenin相互作用,影响β-catenin的泛素化水平,从而调控鼻咽癌细胞的生物学行为和放射敏感性。