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背景纳米口服递药是一种比较理想的给药方式,它具有良好的病人依从性,安全性好,尤其是对易受酶破坏的蛋白类药物具有有效的保护作用,这引起研究者们的广泛关注。由于传统的给药方式注射给药会给病人带来极大痛苦,尤其对于需长时间给药的慢性病患者,长期采用注射给药方式会给病人身体和精神造成伤害。为了改变这种现状,研究者们一直在寻找有效的替代方式。目前,随着科学技术的发展,纳米粒口服递药作为一种具有很大潜力的给药方式,引起研究学者们很大研究兴趣,所以纳米口服递药系统得到快速发展。胰岛素（INS）是由胰岛β细胞分泌的一种蛋白类激素,在体内和胰高血糖素共同参与维持体内血糖平衡,目前Ⅰ型糖尿病的有效治疗方法就是通过注射胰岛素,同时,胰岛素对Ⅱ型糖尿病的治疗也有显著作用。所以,胰岛素是一种十分重要的蛋白质类降血糖药物。海藻酸盐是一种聚阴离子高分子材料,目前市场上主要的海藻酸盐多为钠盐即海藻酸钠,因易获得,低成本,良好的生物相容性,和很好的生物降解性等优点而被广泛的应用于各个领域,此外,海藻酸钠因具有良好的凝胶性和成膜性被广泛应用于医疗的敷料和食品包装材料,具有很高的商业价值和应用前景。穿膜肽（cell-penetrating peptides CPPs）是一段由正电荷氨基酸组成能有效穿过细胞膜的短肽,毒性较低,被广泛用于生物活性分子的跨膜载体,所以穿膜肽在递药方面作为纳米材料的修饰也有诸多研究。基于海藻酸钠良好的生物特性、安全性和穿膜肽R8有效的穿膜效果,结合纳米递药系统自身的优势,穿膜肽修饰的海藻酸钠纳米粒可作为一种有效的纳米口服递药系统以期实现良好的递药应用。实验目的本课题设计了一种复合纳米粒,R8修饰的海藻酸钠载胰岛素纳米粒（INS-SA/R8NPs）,来实现蛋白类生物大分子药物的口服递送,在该递药系统中胰岛素作为一种模式药物。对纳米粒进行理化表征和稳定性研究,并在细胞水平探究了纳米粒的安全性和穿膜效果,另外,对纳米粒在肠绒毛的吸收效果和穿膜机制作进一步探索。证明该纳米递药系统具有良好的递药效果和很大应用前景,为纳米口服递药的发展提供良好的应用基础。实验方法1.制备表征:采用乳化法制备SA NPs,INS-SA NPs,SA/R8 NPs和INS-SA/R8 NPs四种纳米粒,并对这几种纳米粒的粒径,表面电位,元素含量进行测定分析。利用高效液相测定纳米粒的包封率和载药率。通过透射电镜和粒度仪观察纳米粒的外在形态和分布情况。利用傅里叶变换红外光谱（DR-FTIR）分析R8作为外包材料是否成功包被到纳米粒上。2.纳米粒的稳定性和体外释放:评价纳米粒在胃肠道中的稳定性,对于纳米粒能否用于口服递药的可行性分析是至关重要的。通过在透射电镜下观察纳米粒的形态,在模拟胃肠道环境中不同作用时间形态是否完整来评价纳米粒在胃肠道中的稳定性。此外,在不同pH下评价胰岛素从纳米粒中释放情况来分析纳米粒在胃肠道中的可能释放情况。3.细胞毒性和细胞摄取:用MTT法评价SA NPs,INS-SA NPs,SA/R8 NPs和INS-SA/R8 NPs四种纳米粒对Caco-2细胞的毒性,来评定纳米材料的安全性。用FITC标记的胰岛素,制备INS-SA NPs和INS-SA/R8 NPs两种荧光标记的纳米粒,分别处理Caco-2细胞,用荧光显微镜观察在不同时间下两种纳米粒在Caco-2细胞的摄取情况。4.跨膜转运和肠绒毛吸收评价:利用Caco-2细胞建立模拟人肠上皮结构模型来评价纳米粒肠道吸收能力,首先用FITC标记游离的胰岛素,INS-SANPs和INS-SA/R8 NPs三组样品,在Caco-2模型上测定在不同时间三种样品的转运效率,以及反应后Caco-2细胞电阻恢复值来评定细胞层恢复能力。此外,SD大鼠肠道被用来进一步评价纳米粒的吸收作用,同样用FITC标记的胰岛素,INS-SANPs和INS-SA/R8 NPs三组样品分别注射到鼠肠道内,作用一定时间后做进一步处理,用荧光显微镜观察三组样品在肠道的吸收情况。5.吸收机制的探究:利用不同吸收方式的抑制剂来预处理Caco-2细胞,然后FITC标记的INS-SA NPs和INS-SA/R8 NPs作用于预处理的细胞,通过比较不同处理组吸收效果来探究纳米粒可能吸收方式。利用NO探针（DAF-FMDA）进一步探索R8是否通过产生NO调节纳米粒的吸收效果。结果1.通过透射电镜观察和粒径,电位的测量结果显示,纳米粒被成功制备,并且分布均匀;R8修饰后的纳米粒粒径约在300nm,并带正电荷,有利于在体内的跨膜运输;元素分析和红外光谱图结果证明R8成功修饰了 INS-SANPs。2.R8修饰的纳米粒在模拟胃肠道环境中具有很好的稳定性,在胃肠道pH环境中的释放曲线表明R8修饰后的纳米粒具有良好的控释作用。3.体外细胞毒性实验结果表明纳米粒是一种无毒的递药载体。细胞摄取结果表明R8修饰的载药纳米粒具有优越的穿膜能力。4.通过Caco-2细胞模型评价纳米粒跨膜转运的结果表明,R8修饰的载药纳米粒与未被修饰的载药纳米粒相比具有较好的穿膜效果,同时鼠肠道绒毛吸收实验结果表明,R8修饰后的纳米粒具有较好的肠道吸收效果。5.通过对纳米粒吸收机制的探索结果表明R8修饰的载药纳米粒和未修饰载药纳米粒的入胞机制相似,主要以网格蛋白介导的内吞方式和小窝蛋白介导的内吞方式为主。通过观察NO的胞内含量,结果表明R8介导的NO参与了纳米吸收作用的调节。结论在本课题研究中,我们合理设计并成功制备了 R8修饰的海藻酸钠载胰岛素纳米粒。通过理化表征和稳定性研究结果表明纳米粒具有均匀的粒径,带正电荷和良好的稳定性;体外毒性评价和细胞摄取研究证明INS-SA/R8 NPs无细胞毒性和良好的入胞能力;通过Caco-2细胞模型的跨膜运输评价和鼠肠道吸收研究,结果表明R8修饰后的纳米粒其穿膜性得到显著提高;此外,对纳米粒吸收机制的探索表明,纳米粒的跨膜运输主要以网格蛋白介导的入胞方式和小窝蛋白介导的入胞方式为主。通过对该递药系统的评价,结果表明R8修饰的海藻酸钠载胰岛素纳米粒是一种有效的口服递药系统并有潜在的应用价值。