【摘 要】
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灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）是一种担子菌,在其短暂的生活周期中可以形成典型的子实体,生长速度比较快,且子实体具有较长的菌柄,是研究真菌细胞壁伸长生长的理想材料。通过实验室早期的研究发现,从原基的形成到伞盖的自溶,灰盖鬼伞在生长阶段最典型的特征就是菌柄的不断伸长,随着子实体的不断成熟,菌柄伸长生长的能力逐渐减弱,在整个生长周期中,只有菌柄顶端的1-9mm始终保持着快速伸长生长的
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灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）是一种担子菌,在其短暂的生活周期中可以形成典型的子实体,生长速度比较快,且子实体具有较长的菌柄,是研究真菌细胞壁伸长生长的理想材料。通过实验室早期的研究发现,从原基的形成到伞盖的自溶,灰盖鬼伞在生长阶段最典型的特征就是菌柄的不断伸长,随着子实体的不断成熟,菌柄伸长生长的能力逐渐减弱,在整个生长周期中,只有菌柄顶端的1-9mm始终保持着快速伸长生长的能力,基部和膨大区随着子实体的成熟,伸长生长能力逐渐消失,停止生长。进一步的研究发现,特定的几丁质酶Chi E1和Chi III可以重组热灭活的顶端菌柄细胞壁伸长,但不能重组热灭活的基部菌柄细胞壁的伸长活性。这些结果提示菌柄细胞壁停止伸长生长是由于菌柄细胞壁在成熟过程中发生了修饰、交联和硬化作用,导致细胞壁伸长作用丧失。本论文以停止伸长生长的6cm的灰盖鬼伞子实体菌柄基部为实验材料,通过恢复停止伸长生长的成熟菌柄细胞壁伸长活性的研究,阐明菌柄成熟过程中菌柄细胞壁发生的交联、修饰和硬化过程的分子机制。本论文以几丁质酶Chi E1能重组诱导热灭活灰盖鬼伞顶端菌柄细胞壁的伸长作用,但不能重组诱导热灭活基部菌柄伸长作用为实验模型,分析不同多糖水解酶预处理基部菌柄细胞壁是否可以恢复成熟菌柄细胞壁对几丁质酶Chi E1的敏感性。研究发现,Chi E1不能重组热灭活的6cm基部菌柄的伸长活性,但是通过葡聚糖酶ENG预处理热灭活基部菌柄细胞壁之后,Chi E1就能重组ENG预处理的基部菌柄的伸长活性,并且伸长活性的高低对酶的浓度表现出了一定的依懒性。通过HPACE-PAD和二级质谱法对ENG预处理基部菌柄细胞壁水解产物的分析及鉴定,发现葡聚糖酶ENG在对菌柄细胞壁进行预处理的过程中,细胞壁释放出了葡萄糖、Glc 1-3 Glc二糖、Glc 1-6 Glc 1-3 Glc三糖、Glc 1-6 Glc 1-6 Glc 1-6 Glc四糖、Glc 1-6 Glc 1-6 Glc 1-6 Glc 1-6 Glc五糖和Glc 1-6 Glc 1-6 Glc 1-6 Glc 1-6 Glc 1-6 Glc六糖,这些产物的结构显示了产物是葡聚糖酶ENG作用于细胞壁中的β-1,6分支β-1,3葡聚糖成分产生的。对几丁质酶Chi E1重组成熟菌柄细胞壁伸长活性过程中释放产物的分析表明,几丁质酶在成熟菌柄细胞壁中不能发挥水解作用,没有N-乙酰氨基葡萄糖和几丁质二糖的释放,但经葡聚糖酶ENG预处理过的成熟菌柄细胞壁,在几丁质酶Chi E1重组诱导细胞壁伸长作用时,可以水解产生葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和几丁质二糖,这是细胞壁中几丁质微丝水解释放出来的产物,提示ENG预处理成熟菌柄细胞壁,可使细胞壁中几丁质组分易被Chi E1所降解,诱导菌柄细胞壁伸长。为进一步揭示葡聚糖酶ENG预处理可以恢复细胞壁可扩张性的机理,对细胞壁的超微结构进行了观察。通过场发射扫描电镜,观察了6cm菌柄细胞壁的不同部位,以及不同预处理之后的基部菌柄细胞壁的超微结构,发现在菌柄的不同部位,细胞壁的结构是不同的。菌柄顶部区域细胞壁外表面覆盖有较少的无定型物质以及颗粒物,内表面微丝横向排列;在菌柄停止伸长的基部区域,细胞壁外表面和内表面都覆盖有大量的颗粒物质以及不定型物质,基本看不到微丝结构或有少量微丝结构松散杂乱排列。经过不同的处理,发现葡聚糖酶ENG预处理过,几丁质酶Chi E1可以重组伸长的基部菌柄细胞壁,可以看到外表面和内表面有清晰的微丝结构,并且微丝松弛,出现缝隙结构;单独用葡聚糖酶ENG预处理的基部菌柄细胞壁,可以观察到内外表面清晰的微丝结构,但是没有缝隙结构出现,单独用几丁质酶Chi E1不能重组伸长的基部菌柄细胞壁,内外表面覆盖有大量的不定型物质,看不到微丝结构,也没有出现缝隙结构。通过对基部菌柄细胞壁伸长活性的测定,对不同处理条件下细胞壁释放产物的分析及鉴定,以及对细胞壁超微结构的观察,首次发现了细胞壁成熟停止生长、失去伸长活性与细胞壁中的β-1,6-分支β-1,3-葡聚糖的存在有密切的关系。我们推设,顶端菌柄细胞壁中几丁质和葡聚糖交联度小,具有可扩张性,加热灭活之后可以在几丁质酶Chi E1的作用下重组诱导伸长活性,随着菌柄的不断成熟,细胞壁中几丁质和葡聚糖之间的交联程度增加,使得基部细胞壁失去可扩张性,加热灭活后的细胞壁不能被几丁质酶Chi E1重组诱导伸长,葡聚糖酶ENG可以部分降解葡聚糖,打断几丁质与葡聚糖之间的交联,恢复细胞壁的可扩张性,所以用葡聚糖酶ENG预处理过的细胞壁,能被几丁质酶Chi E1重组诱导伸长活性。
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