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鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是一种条件致病菌,在自然及医院环境广泛存在,可在住院患者体内多部位定植,引起各种感染。随着抗菌药物的广泛使用,鲍曼不动杆菌对常用抗生素的耐药率逐年增加,强耐药鲍曼不动杆菌已成为全球抗感染领域的挑战。研究表明,鲍曼不动杆菌的耐药性与毒力呈现共进化趋势,而调控机制尚不清楚。研究表明,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)UCBPP-PA14株中CRISPR-Cas系统可以抑制其毒力。但是关于鲍曼不动杆菌的CRISPR-Cas系统是否参与调控耐药性与毒力未见报道。本研究通过探究鲍曼不动杆菌CRISPR-Cas系统与耐药性和毒力的关系,为临床治疗鲍曼不动杆菌感染提供新的思路。一、cas1基因表达导致鲍曼不动杆菌耐药性和毒力减弱鲍曼不动杆菌AB43株的CRISPR相关蛋白(Cas)的基因包括cas1、cas3、csy1、csy2、csy3、csy4基因,Cas1蛋白在适应阶段负责外源基因间区的获取,对鲍曼不动杆菌在新环境中的适应具有重要作用。为探究鲍曼不动杆菌CRISPR-Cas系统对耐药性及毒力的调控作用,构建了鲍曼不动杆菌cas1过表达株AB26::cas1和AB29::cas1,检测过表达株耐药性、血清抗性、生物膜形成能力、生长情况、小鼠存活率等的变化。结果显示,纸片扩散法表明过表达株AB26::cas1对临床常用的9大类22种抗生素中的3种由耐药变为敏感,AB29::cas1株耐药性无变化;正常人血清与灭活血清孵育后存活性检测发现野生株AB26、AB29与过表达株AB26::cas1、AB29::cas1血清抗性无统计学差异;0.5%结晶紫染色法检测发现AB26::cas1株生物膜形成能力较AB26株弱,且具有统计学差异,AB29::cas1株生物膜形成能力与AB29株相比无统计学差异;紫外分光光度仪比浊法绘制的生长曲线表明AB26::cas1、AB29::cas1株生长速度较AB26、AB29株慢;腹腔注射接种法发现AB26::cas1株小鼠体内感染死亡率较AB26株弱,提示鲍曼不动杆AB26::cas1株体内毒力较AB26株减弱。为研究AB26::cas1过表达株耐药性及毒力变化的机制,采用荧光定量PCR检测耐药、毒力相关基因mRNA量的变化,结果显示,大部分耐药基因mRNA的表达量下降,rpsJ、plc、bauE、lpxB 4种基因mRNA的表达量上升。上述结果提示来源于AB43株的cas1基因可以抑制鲍曼不动杆菌的耐药性、生物膜形成能力、生长速度,也可以抑制细菌对小鼠的致病性,降低小鼠的致死率。二、鲍曼不动杆菌cas1基因缺失株耐药性和毒力增强上述研究证实了单独cas1基因对耐药、毒力的作用,但因为AB26、AB29株可能不含有完整的CRISPR-Cas系统,不能表明真实存在该系统时细菌中cas1基因的作用,于是构建了鲍曼不动杆菌基因缺失突变株AB43Δcas1,结果发现突变株的耐药性增强、血清抗性无差别、生物膜形成能力增强、生长速度变快。为探究突变株的体内毒力变化,采用腹腔注射法构建鲍曼不动杆菌AB43Δcas1突变株的小鼠菌血症模型。为研究AB43Δcas1突变株耐药性及毒力变化的机制,采用荧光定量PCR检测耐药、毒力基因mRNA量的变化。结果显示,鲍曼不动杆菌AB43Acas1突变株感染小鼠的死亡率较AB43株高,提示鲍曼不动杆菌AB43Acas1株体内毒力较AB43株上升;大部分耐药基因 mRNA 量的表达上升,CRISPR簇、cas1、cas3、csy4、adeR、adeC、adeN、adeL、adeH、adeG、entE、basH、lpx、lpxB、lpxC、lpxD、lpxL、bauB、bauC、pbpG、csrA等21种基因的表达下降。上述结果进一步提示鲍曼不动杆菌AB43株中CRISPR-Cas系统cas1基因抑制鲍曼不动杆菌的耐药性、生物膜形成能力、生长速度,也可以抑制细菌致病性从而降低感染小鼠死亡率。三、adeB基因变异介导鲍曼不动杆菌多药耐药在上述研究中,cas1基因过表达和敲除后多种耐药、毒力基因mRNA量的变化可相互印证。如外排泵基因adeB在AB26::cas1中mRNA表达下降了 8.55±2.00倍,而在AB43Δcas1缺失株中mRNA表达上升了 2.42±0.01倍,正反两方面提示adeB mRNA表达量的差异可能与突变株耐药性的改变有关。为明确adeB等耐药基因与耐药表型的对应关系,揭示CRISPR-Cas系统对其调控机制,本研究首先用纸片扩散法检测收集的68株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药性,然后PCR筛查了碳青霉烯类抗生素耐药相关基因,结果发现adeB等许多耐药基因在敏感菌株中也有分布。为揭示DNA水平耐药基因未能产生耐药表型的机制,一方面分别克隆了耐药菌株和敏感菌株来源的adeB基因,进行了序列比对分析,另一方面利用AB43株分别构建了敏感株和耐药株来源adeB基因的原核表达重组菌株,荧光定量PCR检测了adeB表达量的差异,并比较了野生株和重组株的药敏性、生长曲线、生物膜形成能力、血清抗性、小鼠致死率等特性。结果发现,耐药菌株来源的RadeB基因序列和开放阅读框均变短,且同源区也存在3个密码子的变异,其在AB43株中的表达会导致鲍曼不动杆菌耐药性升高、生长速度减慢、生物膜形成能立增强、小鼠体内致死率增高。提示鲍曼不动杆菌RadeB基因不但可编码耐药性,还与毒力有关。细菌进化过程中CRISPR-Cas系统与RadeB基因间可能存在某种竞争关系,在抗生素选择压力下,RadeB基因得以保留,CRISPR-Cas系统则丢失完整结构和功能;但在不存在选择压力的环境下,CRISPR-Cas系统可能通过某种机制对RadeB基因发挥插入失活及基因编辑,使之变异为类似AB43株中存在的无耐药及毒力活性的长片段SadeB基因。