目的：　　2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)是由环境、基因及内分泌等因素引起的一种病理状态。全球的患病数量及对于T2DM科研和治疗上的花费正逐步加大，中国的T2DM患者占总人口比例已接近10％，成为威胁国人健康的第一大疾病。T2DM可引起多系统损害，如冠心病、缺血性或出血性脑血管疾病、肾动脉硬化、肢体动脉硬化闭塞症，多年来对于T2DM的临床治疗一直采用传统的保守治疗，但药物治疗和胰岛素替代疗法不能延缓T2DM患者并发症的出现及改善预后。　　近些年来，减肥外科医生进行减肥手术时发现:接受胃旁路(Roux-en-Y gastricbypass，RYGB)手术的合并T2DM的肥胖病人，术后血糖降至正常，并能长期维持，但其作用机理目前仍未完全清楚。目前研究发现体内的脂肪组织不仅是一个被动的能量储存的器官，它还是一个调节机体内分泌、能量代谢及炎症的内分泌器官。脂肪组织可以分泌多种激素和细胞因子，其中脂联素是一种重要的脂肪细胞因子家族成员，其血浆水平在胰岛素抵抗和肥胖的情况下降低，在胰岛素敏感性增加和体重减轻时上升。肝脏是葡萄糖代谢的重要器官，具有糖原合成、分解和异生作用。它参与调节机体糖的储存和分布，维持血糖相对稳定，使各组织能够不断得到葡萄糖供应。当肝脏功能因各种肝病而受损时，往往影响其正常糖代谢，出现糖耐量减低，部分患者最终发展成糖尿病。　　目前认为2型糖尿病患者的胰岛素水平并不降低，但是肝脏、肌肉及脂肪组织等外周器官存在胰岛素抵抗，因此我们将重点研究作为机体能量代谢中最重要的器官肝脏，并应用HepG2细胞系离体实验研究其作用机制，来解释RYGB术后是否能够缓解肝脏的胰岛素抵抗。　　方法：　　一、实验材料与仪器　　8周龄SPF级雄性GK大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。周龄性别匹配的Wistar大鼠购自中国医科大学附属盛京医院实验动物中心。HepG2细胞系购自美国国立细胞库（American Type Culture Collection，ATCC）。　　10％水合氯醛;RPMI1640培养基;exendin-4;抑肽酶;胰蛋白酶;二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidylpeptidase-4，DPP-4);乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA);大鼠AdipoR2抗体;聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF);大鼠胰岛素酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒;大鼠adiponectin ELISA试剂盒;等。　　显微手术器械，细胞培养工作台，SANYO MDF-U超低温冰箱，OLYMPUSAX70倒置显微镜，GFL THERMOLAB振荡水浴箱，PCR扩增仪;高速冷冻离心机，电泳仪，半干转印仪，电子天平，微量泵，PH计，血糖仪及血糖试纸等。　　二、实验方法　　（一）实验分组及处理　　GK大鼠20只，Wistar大鼠10只分为以下三组:　　1、RYGB组:GK大鼠10只。贲门处横断，远断端结扎闭锁。Treitz韧带远端10 cm横断空肠，远端肠袢经结肠前上提与食管断端吻合，近端肠袢在食管空肠吻合口远侧10 cm处与远端肠袢行空肠间侧侧吻合。旷置胃、十二指肠和上段10 cm空肠。　　2、GK组:GK大鼠10只。在贲门处切断后再吻合，距Treitz韧带10 cm处切断空肠后原位端端吻合，未改变胃肠道正常解剖结构。　　3、WS组:Wistar大鼠10只，同GK组行假手术，作为非糖尿病正常对照。　　在第一部分，检测手术前后大鼠体重、摄食率、空腹血糖(fasting blood sugar，FBS)、口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）、血浆胰岛素、以及胰岛素抵抗的变化。测手术前后大鼠血浆adiponectin以及肝脏组织AdipoR2受体表达的变化，肝细胞内AMPK，IRS-2的变化，探讨RYGB手术如何缓解GK大鼠肝脏胰岛素抵抗。　　在第二部分，通过体外细胞实验，检测HepG2细胞AdipoR2在不同浓度脂联素作用下的变化，以及siRNA沉默AdipoR2后，HepG2细胞内受体和酶的变化，探讨脂联素对肝细胞糖代谢影响的作用机理，解答RYGB术后肝脏缓解胰岛素抵抗的机制。　　（二）检测方法　　1、电子称测量体重及摄食量，计算摄食率:摄食率=摄食量(g)/体重(Kg)/天。　　2、血糖仪法检测空腹血糖(FBS)和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。　　3、酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测血浆胰岛素和脂联素的水平。　　4、Real-time PCR检测肝脏的AdipoR2，AMPK，IRS-2 mRNA的变化，AdipoR2siRNA转染前后HepG2细胞AdipoR2，AMPK，IRS-2，G6Pase，PEPCK和GLUT2mRNA的变化。　　（三）统计学处理　　实验数据采用均数±标准差（(x)±s）表示，用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05差异具有显著性。　　结果：　　一、RYGB手术对缓解GK大鼠肝脏胰岛素抵抗的影响　　结果显示RYGB与GK组术前存在明显的胰岛素抵抗，血糖、OGTT等糖尿病指标显著高于WS组大鼠。但RYGB术后两组相比，术后血糖、OGTT、C-肽、HOMA-IR基本恢复至正常水平，血浆脂联素水平升高。　　肝细胞AdipoR2 mRNA水平上RYGB组比WS组上调2.47倍，因此说明RYGB不仅可以影响血液中脂联素的浓度，而且对肝细胞的AdipoR2也有上调的作用。GK组大鼠肝脏组织中AdipoR2 mRNA水平均降低，说明长期高糖作用下不仅降低脂联素和胰岛素敏感性的同时，而且下调AdipoR基因的表达，使机体不仅没有足量的adiponectin发挥增加胰岛素敏感性的生理效应，而且AdipoR表达减少进一步导致了脂联素不能有效结合受体发挥作用。　　我们实验结果中表明肝细胞的AMPKα2 mRNA水平上RYGB组比WS组上调1.81倍，IRS-2 mRNA水平在RYGB组比WS组上调3.24倍，说明RYGB术后脂联素升高，通过脂联素受体，作用于AMPK信号通路，增加葡萄糖利用，减少肝糖原异生，并通过上调IRS-2，达到缓解胰岛素抵抗的作用。　　二、脂联素改善HepG2细胞葡萄糖利用的实验研究　　实验结果显示50μg/ml浓度全长脂联素处理培养的HepG2细胞24h后，AMPK，IRS-2和GLUT2在基因水平均有上调（P＜0.05），而PEPCK，G6Pase基因下调（P＜0.05），通过我们的实验说明高浓度的全长脂联素对于肝细胞的糖代谢有明显的改善作用，这与我们在体动物实验相一致。实验中采用siRNA沉默AdipoR2基因后，我们发现PEPCK，G6Pase基因水平上调，AMPK和GLUT2下调，由此我们得出结论，减少AdipoR2受体数量可以调节AMPK，GLUT2，PEPCK，G6Pase的水平，这样导致肝细胞的糖异生增加，葡萄糖利用减少，肝细胞胰岛素敏感性降低、最终形成IR。我们的实验结果提示，RYGB术后脂联素水平升高，其通过提高肝细胞AdipoR2表达，上调细胞内的AMPK活性，增加GLUT2和IRS-2数量，降低PEPCK和G6Pase水平，达到增加肝细胞的葡萄糖利用，降低基础状态下肝细胞糖异生，减轻肝细胞的胰岛素抵抗，由此说明RYGB术后脂联素在抑制或延缓肝细胞IR中具有重要的作用。　　结论：　　1、RYGB对非肥胖糖尿病GK大鼠2型糖尿病具有明显的治疗作用。　　2、RYGB后通过升高脂联素，上调肝细胞的AdipoR2，AMPK和IRS-2，增加肝细胞葡萄糖利用，减少肝糖原异生，缓解肝细胞胰岛素抵抗。　　3、脂联素可以上调HepG2细胞的AdipoR2的表达，进而上调INS-2和GLUT2，增加AMPK活性，降低PEPCK和G6Pase的水平。