【摘 要】
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背景和目的恶性肿瘤是导致人类死亡的三大原因之一,严重威胁了人类的生命。通过增强或改善机体免疫力从而提高抗肿瘤能力的肿瘤免疫疗法为治疗选择有限的癌症患者带来希望。然而作为肿瘤免疫治疗代表之一的过继性T细胞疗法（Adoptive T cell therapy,ACT）在实体瘤治疗中效果欠佳,阻碍过继性T细胞治疗发展的重要原因是T细胞在体外培养过程中大多呈现终末分化状态,表达较高水平的免疫检查点分子,在
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背景和目的恶性肿瘤是导致人类死亡的三大原因之一,严重威胁了人类的生命。通过增强或改善机体免疫力从而提高抗肿瘤能力的肿瘤免疫疗法为治疗选择有限的癌症患者带来希望。然而作为肿瘤免疫治疗代表之一的过继性T细胞疗法（Adoptive T cell therapy,ACT）在实体瘤治疗中效果欠佳,阻碍过继性T细胞治疗发展的重要原因是T细胞在体外培养过程中大多呈现终末分化状态,表达较高水平的免疫检查点分子,在回输至患者体内后存活时间较短。随着T细胞生长、发育并发挥其效应功能,机体T细胞由分化程度较低的初始状态逐渐走向记忆或终末分化状态。当再次暴露于相同的抗原时,记忆性T细胞可以迅速增殖并做出更快、更有效的免疫应答。因此,获得更多的记忆性T细胞有利于肿瘤免疫治疗的成功。造血特异性蛋白1（Hematopoietic-specific protein 1,HS1）被认为与造血谱系细胞的分化、活化和凋亡过程有关,造血特异性蛋白1结合蛋白3（HCLS1 binding protein 3,HS1BP3）可与HS1结合,可能参与了淋巴细胞的活化。在T细胞杂交瘤细胞系中过表达突变型的HS1BP3会影响T细胞的功能;另外HS1BP3参与调控凋亡过程,可通过影响酪氨酸和色氨酸羟化酶的活性从而改变细胞代谢途径;HS1BP3也是自噬通路的负调控分子,通过影响磷脂酶活性和磷脂酸生成从而抑制自噬发生。综合目前研究,尚未有研究报道HS1BP3是否参与T细胞记忆分化和肿瘤发生发展过程。因此本研究将探究HS1BP3对CD8+T细胞记忆分化过程和体内抗肿瘤效应的影响,为改善过继性T细胞疗法提供研究基础。方法1.利用在线数据库PrognoScan分析HS1BP3表达与非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者生存的关系。2.磁珠分选NSCLC患者外周血CD8+T细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测HS1BP3和多种记忆标志物的基因表达水平,根据HS1BP3表达水平将患者分为高表达组和低表达组,比较两组患者CD8+T细胞记忆标志物的基因表达水平。3.体外诱导效应性和记忆性CD8+T细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测两组CD8+T细胞HS1BP3的基因表达水平。4.采用琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量PCR和免疫印迹（Western Blot）技术鉴定C57BL/6J HS1BP3-/-基因敲除小鼠。5.流式细胞术检测HS1BP3+/+小鼠和HS1BP3-/-小鼠脾脏T细胞比例、CD8+T细胞记忆分化状态、表面标志物、细胞因子和增殖标志物的表达水平。6.HS1BP3+/+小鼠和HS1BP3-/-小鼠皮下接种肺癌细胞系LLC,测量并计算肿瘤体积和小鼠生存时间。流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏和瘤内免疫细胞比例,检测瘤内CD8+T细胞记忆分化状态、表面标志物和细胞因子表达水平。7.HS1BP3+/+小鼠和HS1BP3-/-小鼠皮下接种肺癌细胞系LLC,第12天手术切除皮下肿瘤,观察肿瘤复发情况及小鼠生存。流式细胞术检测肿瘤未复发的HS1BP3+/+小鼠和肿瘤复发的HS1BP3-/-小鼠外周血和脾脏CD8+T细胞比例、记忆分化状态和表面标志物表达水平。结果1.NSCLC患者HS1BP3表达越高,无复发生存期越长。2.当NSCLC患者CD8+T细胞表达较高水平的HS1BP3时,多种记忆标志物表达也较高。3.体外培养的记忆性CD8+T细胞中HS1BP3表达高于效应性CD8+T细胞。4.成功构建HS1BP3-/-基因敲除小鼠,流式细胞术检测HS1BP3+/+小鼠和HS 1BP3-/-小鼠脾脏T细胞比例并无差异,但HS1BP3-/-小鼠效应记忆性CD8+T细胞比例降低,细胞因子和增殖标志物表达下降。5.HS1BP3-/-小鼠皮下LLC肿瘤体积显著大于HS1BP3+/+小鼠,且生存时间较短;流式细胞术结果显示HS1BP3-/-荷瘤小鼠瘤内CD8+T细胞效应记忆亚群减少且抗肿瘤能力减弱,而其他免疫细胞比例无明显差异。6.HS1BP3-/-小鼠与HS1BP3+/+小鼠相比肿瘤易复发,流式细胞术结果显示肿瘤复发的HS1BP3-/-小鼠脾脏效应记忆性CD8+T细胞显著减少,抗肿瘤能力减弱。结论HS1BP3是NSCLC患者预后较好的生物标志物;当NSCLC患者CD8+T细胞表达较高水平的HS1BP3时,多种记忆标志物表达也较高;HS1BP3可以促进CD8+T细胞效应记忆分化,增强CD8+T细胞抗肿瘤效应并抵抗肿瘤复发,表明HS1BP3是调控T细胞记忆分化的关键分子。
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