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鸭疫里默氏杆菌病（Riemerella anatipestifer infection,RAI）是由鸭疫里默氏杆菌（Riemrella anatipestifer,RA）感染鸭、鹅、火鸡及其他禽类引起的一种以纤维性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎为特征的急性、接触性、败血性传染病。该病具有较高的发病率和死亡率,在世界各地呈广泛性流行,是严重危害养鸭业的主要细菌性传染病之一。RA血清型众多,且不同血清型之间缺乏交叉免疫保护,加之RA对抗菌药物容易产生耐药性,这给RAI的预防控制带来了困难并严重影响食品安全。因此,研制RA新型疫苗显得更为迫切。RA外膜蛋白A（OmpA）和协同溶血素（CAMP）在RA不同血清型菌株中高度保守且具有良好的免疫原性,可作为基因工程亚单位疫苗研制的候选蛋白。因此,本研究在对RA贵州分离株OmpA和CAMP基因进行克隆与分析的基础上,构建OmpA-CAMP融合基因,并通过原核表达系统获得r OmpA-CAMP融合蛋白作为亚单位疫苗,同时制备RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗免疫雏鸭,通过检测雏鸭相关免疫指标,评价r OmpA-CAMP融合蛋白和蜂胶灭活疫苗诱导雏鸭产生的免疫应答,以期为新型RA疫苗的研发与应用奠定基础。1.RA贵州分离株血清型鉴定及其OmpA和CAMP基因克隆与分析为明确RA贵州分离株血清型及其OmpA和CAMP基因特性,本试验采用16S rRNA基因特异性引物对13株RA贵州分离株（RA-SS-1～12株和RA-AS-1株）进行PCR检测分析,以不同血清型RA阳性血清进行玻片凝集试验,然后分别以RA OmpA和CAMP基因特异性引物进行PCR扩增,回收PCR产物进行克隆和生物信息学分析,结果显示:13株RA贵州分离株均可扩增出16S rRNA基因特异性片段,测序发现该13株间特异性片段的核苷酸同源性为98.5%～99.9%,与Gen Bank上15株参考菌株的核苷酸同源性达97.5%～99.9%;经血清型鉴定显示,RA-SS-1～10株为血清2型RA,RA-SS-11～12株为血清11型RA,RA-AS-1株与血清3型和11型阳性血清有交叉凝集反应。经克隆分析可见,13株RA贵州分离株OmpA基因全长均为1 164 bp,可编码387个氨基酸,株间核苷酸同源性为100%,与参考株RA Yb2核苷酸同源性达100%;13株RA贵州分离株CAMP基因全长均为1 026 bp,可编码341个氨基酸,除RA-SS-7株第624位碱基发生同义突变外,其余12株核苷酸同源性均为100%,与RA标准株ATCC-11845核苷酸同源性达100%;RA Opm A和CAMP蛋白均属亲水性蛋白,无跨膜和信号肽区域,含有较多的优势抗原表位结构。这些结果表明,13株RA贵州分离株的优势血清型为血清2型,且OmpA和CAMP基因高度保守并具有良好的抗原特性,可作为制备RA基因工程亚单位疫苗的候选蛋白。2.RA贵州流行株OmpA、CAMP和OmpA-CAMP亚单位蛋白制备随机选取RA贵州流行株（RA-SS-8株）OmpA和CAMP基因质粒为模板,设计合成带linker-（G4S）3的特异性引物,利用SOE-PCR技术扩增OmpA-CAMP融合基因,并将OmpA、CAMP和OmpA-CAMP基因分别克隆至pET-28a（+）载体,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta（DE3）进行IPTG诱导表达,经诱导表达条件优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达蛋白,结果显示:成功构建了pET-28a-OmpA、pET-28a-CAMP和pET-28a-OmpA-CAMP,经IPTG诱导表达的r OmpA、r CAMP和r OmpA-CAMP融合蛋白分子量分别约为45 k Da、37 k Da和83 k Da,其中r CAMP蛋白为可溶性表达,r OmpA和r OmpA-CAMP蛋白为包涵体形式表达;r OmpA、r CAMP和r OmpA-CAMP融合蛋白的最佳诱导表达条件分别为37℃0.2 mmol/L IPTG诱导表达5 h、18℃0.4 mmol/L IPTG诱导表达12h和37℃0.2 mmol/L IPTG诱导表达5 h;r OmpA和r CAMP蛋白可用Ni-NTA亲和层析法纯化,r OmpA-CAMP蛋白宜用切胶纯化法纯化;Western blot显示,纯化r OmpA、r CAMP和r OmpA-CAMP蛋白均能与His-tag单抗发生特异性反应。这些结果表明,本试验成功表达和纯化了r OmpA、r CAMP和r OmpA-CAMP蛋白。3.RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗制备随机选取RA贵州流行株（RA-SS-8株）为基础菌株,经生长曲线测定和灭活条件筛选后,以蜂胶为佐剂制备RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,并进行无菌和安全性检验,结果显示:RA-SS-8株OD600值为0.1～0.8时,该菌处于对数生长期,且OD600值与活菌数呈现良好的线性关系;RA-SS-8株最佳灭活条件为0.2%甲醛溶液、37℃灭活12 h;蜂胶灭活疫苗含菌量为3.8×10~9 CFU/mL,蜂胶干物质含量为10 mg/m L;无菌检验显示,巧克力琼脂培养基上未见菌落生长;安全性检验显示,以2倍免疫剂量接种雏鸭在观察期内未表现出不良反应,大体病变观察未见明显病变。这些结果表明,本试验成功制备了RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗。4.RA贵州流行株亚单位疫苗和蜂胶灭活疫苗免疫效果分析选取7日龄健康麻鸭210只,随机分为融合蛋白组、融合蛋白+CpG ODN组、组合免疫组、蜂胶疫苗组、商品疫苗组和PBS对照组,每组35只,相应以r OmpA-CAMP融合蛋白、r OmpA-CAMP融合蛋白+CpG ODN、r OmpA+r CAMP重组蛋白、蜂胶灭活疫苗、二价灭活疫苗和无菌PBS溶液免疫（7日龄首次免疫、21日龄二次免疫）,于首次免疫前（0 d）和免疫后第7 d、14 d、21 d和28 d时,随机采集试验鸭外周血液样本和脾脏组织,每时间段5只/组,采用ELISA法检测鸭血清RA抗体,CCK-8法检测鸭外周血淋巴细胞增殖情况,q RT-PCR法和检测鸭脾脏IL-2、IL-4、IL-6、IFN-α和IFN-γ基因转录水平,ELISA法检测鸭血清IFN-γ和IL-4分泌水平,结果显示:亚单位疫苗和蜂胶灭活疫苗均能诱导鸭产生RA特异性抗体和刺激鸭外周血淋巴细胞增殖,诱导鸭脾脏IL-2、IL-4、IL-6、IFN-α和IFN-γ基因转录水平上调,促进鸭血清中IFN-γ和IL-4分泌水平升高,在亚单位疫苗中以融合蛋白+CpG ODN组产生效果显著（P﹤0.05）。这些结果表明,亚单位疫苗和蜂胶灭活疫苗均能诱导鸭产生良好的免疫应答反应。5.RA贵州流行株亚单位疫苗和蜂胶灭活疫苗免疫保护分析在融合蛋白组、融合蛋白+CpG ODN组、组合免疫组、蜂胶疫苗组、商品疫苗组和PBS对照组二免后第14 d（即首疫后28 d）,以新制备的RA-SS-8株菌液进行肌肉注射,10只/组,2×10~8CFU/0.5 m L/只,观察计算免疫保护率,同时于攻毒后第7 d（免疫后第35d）时,采集试验鸭心脏和肝脏组织,制作病理切片,观察组织病理变化,结果显示:融合蛋白组、融合蛋白+CpG ODN组、组合免疫组、蜂胶疫苗组、商品疫苗组和PBS对照组攻毒保护率分别为20%、30%、20%、70%、100%和0%。攻毒后第7 d PBS对照组心脏组织外膜增厚,表面附有大量的纤维素性渗出物,肝脏组织被膜增厚,表面附有大量粉红色网状纤维素渗出,肝索排列紊乱;融合蛋白组和组合免疫组出现较对照组轻微的病理变化;融合蛋白+CpG ODN组、蜂胶疫苗组和商品疫苗组未见明显病理变化。这些结果表明,RA亚单位疫苗能诱导鸭产生免疫保护力,但不能像蜂胶疫苗和商品疫苗一样有效地抵抗RA贵州流行株（RA-SS-8株）的攻击。综上所述,RA贵州分离株的优势血清型为血清2型,RA贵州分离株OmpA和CAMP基因高度保守,编码蛋白整体抗原性好;构建得到的重组质粒均能在大肠杆菌中得到良好的表达,且能诱导鸭产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,但均不能有效地抵抗RA贵州流行株（RA-SS-8株）的攻击;制备的RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,能诱导鸭产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,具有良好的保护作用。这些研究结果为RA新型疫苗的研制提供科学依据。