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研究背景:慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis,CGN)的病人发病时间不固定,早期症状不明显。患者肾脏中肾小球持续缓慢累积损伤最终发展为尿毒症(Uremic)。三维基因组学(Three-Dimensional Genomics,3D Genomics)是在三维空间结构上对生物过程进行研究,如不同三维结构的基因组序列在基因转录,复制,修复和调控中发挥作用。外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)含有非常多的免疫细胞,常用于人体免疫系统研究。肾小球肾炎患者免疫细胞和正常人免疫细胞存在基因表达差异,但是我们并不了解免疫细胞基因调控变化导致肾小球损伤的过程。为了探讨三维基因组学的变化差异和疾病的关联,我们对肾小球肾炎尿毒症期患者免疫细胞和正常人免疫细胞进行了Hi-C(High-throughput chromosome conformation capture,Hi-C)分析。目的:本研究利用高通量测序方法,以病人的外周血单核细胞作为研究对象,观察三维基因组学的变化。同时探讨外周血单个核细胞在尿毒症中的发病机制和相关通路的影响机制,为进一步研究外周血单个核细胞和疾病发生的分子机理提供重要帮助。方法:本研究的实验组为20例慢性肾小球肾炎尿毒症期患者,对照组为20例经过体检的健康人。首先,通过密度梯度离心法分离实验组和对照组的外周血单个核细胞,进行外周血单个核细胞的甲醛交联。其次,用限制性内切酶把染色质切成不同片段,同时用生物素对这些片段进行标记、标记好后把片段的平末端用连接酶进行连接并纯化连接产物,制备Hi-C样本,并取样进行第一质控点检测。经过末端修复,加接头A,生物素调取,加测序接头以及PCR条件的筛选和扩增。文库扩增产物取样并进行第二质控点的检测,当检测合格时代表这个文库的制备已经完成。构建好标准文库后进行测序分析。结果:(1)构建了两个样本Hi-C标准文库,从血球计数法到琼脂糖凝胶电泳法对样本进行检测,两个样本结果都符合Hi-C建库的要求。(2)患者组和实验对照组分别获得867,096,347对和953,779,734对滤过Reads对数,滤过的序列占原始下机的Reads对数的比例分别为95.43%和96.28%。(3)尿毒症患者组,有效Reads对数为284,574,670;顺式相互作用的Reads对数为107,006,632;顺式相互作用的Reads对数占有效Reads对数的37.60%;反式相互作用的Reads对数为177,568,038;反式相互作用的Reads对数占有效Reads对数的62.40%。正常对照组,有效Reads对数为439,473,459;顺式相互作用的Reads对数为372,249,382;顺式相互作用的Reads对数占有效Reads对数的84.70%;反式相互作用的Reads对数为67,224,077;反式相互作用的Reads对数占有效Reads对数的15.30%。(4)我们把不同的染色体间的作用强度按照Hi-C数据处理的标准进行标准化后得到不同染色体自身的交互矩阵图,发现位置越近的染色体片段交互数值越高。(5)患者组和对照组的作用强度变化的交互数值基本一致,相同染色体交互数值高于和其他染色体的交互数值,1号染色体到22号染色体交互数值逐渐减弱,到X号染色体交互数值又见明显增强。(6)经过统计在23对染色体中,两组细胞大部分A区B区没有明显变化,从A区转换到B区比例最高的是9号染色体比例为7.11%,从B区转换到A区比例最高的是22号染色体比例为7.39%。(7)两组细胞都有一些特有的TAD边界,患者组的TAD边界数为1001,对照组边界数为1166,共同边界数为780。两组免疫细胞的染色体片段TAD边界有差异,但两组细胞中约有70%的TAD边界是相同的。结论:(1)原来Hi-C的动物标本都是癌细胞组织或者常规的细胞标本,本实验直接使用人体外周血标本进行建库。获得人体疾病或者健康的组织器官进行Hi-C建库相对困难,本实验的外周血标本获取相对容易。(2)本实验对Hi-C实验流程中某些步骤的进行改进和进一步优化,样本质量控制合格,成功制备Hi-C分子和构建了标准文库。从外周血提取的单个核细胞建立了一套人体免疫细胞Hi-C的标准操作流程,这可以为以后的外周血Hi-C建库提供借鉴。(3)本次测序绝大多数的交互作用会落到同一染色体同一区域内,极少的交互作用会落到同一染色体其他区域,表明交互作用并不是随机作用。大多数相互作用是同一条染色体的作用,很少发生在不同染色体间相互作用,这表明染色体不是随机分布在细胞核内。(4)较长的染色体趋于靠近并作用较长的染色体,而较小的染色体趋于作用和靠近较小的染色体。(5)患者组和对照组的作用强度变化的基本一致,相同染色体相互作用强于和其他染色体的作用,1号染色体到22号染色体相互作用强度逐渐减弱,到X号染色体作用强度又见明显增强。(6)N20和U20两组细胞基因组显示出开放和闭台区室的相似分布。只有某些区域有A到B区室或者B到A区室的转化,这些转化区域中的很多基因与疾病通路相关。A/B compartments变化暗示患者组和对照组在9号染色体和22号染色体存在较多基因表达调控的变化。(7)TAD滑动边界具有很强的保守性。TAD发生边界的变化可能会促进基因表达的改变。TAD边界在两组细胞之间基本一致的,但也存在TAD边界差异,这些差异边界可能和尿毒症发生具有相关性。