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本文对来源于三种宿主植物的固氮细菌进行分离鉴定,获得如下结果:
1.采用Nfb、DN和蔗糖三种不同的培养基对高杆野生稻、香附子、牛筋草中的固氮细菌进行分离,获得89株固氮细菌,其中38株来源于野生稻,42株来源于香附子,9株来源于牛筋草。
2.采用SDS-PAGE全细胞蛋白电泳将这些菌株进行初步归类,在80%的相似性水平上,分为11个类群,7个单株。
3.有些类群的菌株在宿主的不同的部位(根、茎、叶)都可以分离到,如类群Ⅲ,类群Ⅶ,类群Ⅷ,类群Ⅸ,类群Ⅺ。其他类群的菌株一般分布在宿主的茎和叶中。
4.类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ的菌株和菌株YJ42、YD11、Y3341、Y411、YC14、YD15、Y543在半固体培养基中均有乙炔还原活性。活性最小为8 nmol C<,2>H<,2>/ml/h,最大可达736.6 nmol C<,2>H<,2>/ml/h。超过100 nmol C<,2>H<,2>/ml/h的有52株菌。
5.各类群代表菌株的16S rRNA基因部分序列分析结果表明,类群Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ的代表菌株分别与多环芳烃降解菌OAr/s-degrading strains)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilial)、嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilial)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、克氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)亲缘关系较近。类群Ⅰ与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、类群Ⅺ与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae subsp.dissolvensstrain SREPS 3)、类群Ⅵ与根瘤菌(Rhizobium sp.vgs-5)的16S rRNA基因部分序列相似性为98%。
6.对类群Ⅰ、Ⅵ、Ⅺ的代表菌株和对应的模式菌株进行16S rRNA基因全序列系统发育分析、G+Cmol%测定、DNA-DNA同源性杂交、IS-PCR指纹图谱分析、SDS-PAGE全细胞蛋白电泳图谱分析、细菌全细胞脂肪酸成份分析、鞭毛染色、革兰氏染色、碳源利用及生理生化测定。结果表明:
YG101所代表的类群Ⅰ与阴沟肠杆菌16S rRNA基因全序列相似性达到98%。但是其与阴沟肠杆菌的DNA-DNA杂交同源性仅为23.8%,而且其它生理生化特性也并不一样,为一新种。该新种为革兰氏阴性细菌,长杆状细胞,侧生多鞭毛,Cr+Cmol%为58.5%,处于肠杆菌的G+Cmol%含量范围中,具有固氮酶活性。可利用糊精等多种碳源。
类群Ⅵ(代表菌株YJ501)与根瘤菌(Rhizobium sp.vgs-5)的16S rRNA基因全序列相似性百分比为96%,它能使大豆结瘤,革兰氏染色阴性,圆杆状细胞,单侧生鞭毛。G+Cmol%为58.8%,位于根瘤菌属的G+Cmol%范围(59%~64%)内。DNA同源性分析表明其与根瘤菌的相关种同源性都比较低,与Rhizobium indigoferae CCBAU71714的同源性为22.9%,与Rhizobium huantiense USDA 2370的同源性为28.1%,与Agrobacterium rhizogense IAM 13570的同源性为31.5%。可利用糊精等碳源。
Y3201所代表的类群Ⅺ的16S rRNA基因全序列与阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae ATCCl3047)的相似性为98%,然而SDS-PAGE全细胞蛋白电泳带型分析、IS-PCR插入序列指纹图谱分析、全细胞脂肪酸成分分析、系统发育地位分析、Bilog板碳源利用分析、鞭毛染色等形态学鉴定、G+Cmol%及DNA-DNA杂交同源性分析等的方法都证明了类群Ⅺ是一种完全不同于阴沟肠杆菌的细菌。该新种为革兰氏阴性细菌,圆杆状细胞,端生单鞭毛,G+Cmol%为63.7%,接近于肠杆菌的G+Cmol%含量范围中,与阴沟肠杆菌模式菌株的DNA同源性为30.8%,具有固氮酶活性,能利用淀粉等多种碳源。