【摘 要】
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目的:本课题组既往研究表明金钗石斛生物碱（DNLA）可以改善多种阿尔茨海默病（AD）模型的认知缺陷。本研究进一步使用快速衰老小鼠8（SAMP8）研究DNLA的改善认知障碍的作用,并探讨其可能的作用机制。方法:第一部分:非标记定量磷酸化蛋白质组学研究金钗石斛生物碱对SAMP8小鼠的作用机制:雄性6月龄SAMP8小鼠随机分为3组,SAMR1组、SAMP8组和DNLA 20 mg/kg组,灌胃给药,每日
【基金项目】
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国家自然科学基金（81773739）+石斛碱抗衰老作用及机制研究；
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目的:本课题组既往研究表明金钗石斛生物碱（DNLA）可以改善多种阿尔茨海默病（AD）模型的认知缺陷。本研究进一步使用快速衰老小鼠8（SAMP8）研究DNLA的改善认知障碍的作用,并探讨其可能的作用机制。方法:第一部分:非标记定量磷酸化蛋白质组学研究金钗石斛生物碱对SAMP8小鼠的作用机制:雄性6月龄SAMP8小鼠随机分为3组,SAMR1组、SAMP8组和DNLA 20 mg/kg组,灌胃给药,每日1次,连续6月。行为学检测后,采用非标记定量磷酸化蛋白质组学检测,利用GO数据库、KEGG数据库和STRING数据库对磷酸化蛋白组学数据进行统计分析,预测DNLA改善SAMP8小鼠学习记忆障碍的可能机制。第二部分:DNLA通过抑制内质网应激减轻SAMP8小鼠学习记忆障碍:4月龄雄性SAMP8（n=64）和同月龄SAMR1（n=13）小鼠随机分为5组:SAMR1对照组、SAMP8模型组、DNLA 20 mg/kg、DNLA 40 mg/kg和二甲双胍（Met,80 mg/kg）组,每日1次,连续6月。Y迷宫和新物体识别实验检测小鼠空间辨别学习记忆能力;HE染色观察其形态学改变;Nissl染色观察神经元内尼氏体的变化;电镜观察细胞内内质网结构的改变;Western blot分析内质网应激相关蛋白和抗衰老因子的表达。第三部分:金钗石斛生物碱减少Aβ的沉积减轻SAMP8小鼠学习记忆障碍:分组和给药同第一部分,Western blot分析Aβ生成的相关蛋白酶的表达。结果:第一部分:非标记定量磷酸化蛋白质组学以Ascore＞=10,Significance＞13（p＜0.05）,Fold change＞1.2为标准筛选磷酸化差异表达肽段,研究表明SAMP8组与SAMR1组相比,共筛选得到196个差异肽段,DNLA给药组和SAMP8组相比,筛选到38个差异肽段,其中在SAMP8小鼠脑组织中发生显著磷酸化修饰变化的肽段,有31个肽段能被DNLA显著逆转。在蛋白质功能层面,磷酸化水平显著性变化的蛋白质主要与“结合”等功能相关;在信号通路层面,这些蛋白质参与2条信号转导通路,包括调节内质网蛋白质加工通路和甲状腺激素的合成通路;在蛋白质相互作用层面,差异磷酸化蛋白质形成以MAP1A和MAP1B为核心的蛋白质相互作用网;研究数据还表明PKCα、MARCKS、Neurosecretory protein VGF、Hsp40、RTN1、NFM等蛋白的磷酸化水平在各组间的变化。第二部分:Y迷宫和新物体识别实验表明DNLA能有效地改善SAMP8小鼠的学习记忆能力,HE染色观察发现DNLA能减轻神经元损伤;Nissl染色观察发现DNLA可改善海马和前额叶皮层神经元损伤。电镜结果表明DNLA能改善海马神经元的内质网扩张和肿胀。DNLA可以调节PERK信号通路,相继抑制calpain 1、GSK-3β、Cdk5的活性,最终减少Tau蛋白的过度磷酸化。DNLA还可增加抗衰老因子Sirt1和Fox O1的表达。第三部分:Western blot检查结果表明,DNAL可增加SAMP8小鼠海马和前额叶皮质中ADAM17的蛋白表达和减少APP、ADAM10、BACE1、PS1蛋白表达,最终减少Aβ的产生,降低Aβ的神经毒性。结论:DNLA可改善老年SAMP8小鼠的学习和记忆障碍,减轻神经元损伤和丢失,这些作用可能是通过抑制内质网应激信号通路,调节APP剪切酶活性,减少Aβ生成,逆转异常磷酸化蛋白,从而减轻SAMP8小鼠的病理改变。
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