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随着畜禽集约化养殖的兴起,抗菌药物越来越广泛地使用。恩诺沙星为动物专用的氟喹诺酮类抗菌药物,因抗菌谱广,抑杀活性强,而被广泛用于防治畜禽呼吸道和肠道感染。医学临床显示氟喹诺酮类抗菌药长时间或超剂量使用,会产生肝脏毒性作用。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)为革兰阴性菌细胞壁的一种成分,细菌死亡溶解时,会释放大量LPS,对宿主产生毒性,特别是肝毒性。本文籍体外建立的鸡原代肝细胞培养模型,用LPS和恩诺沙星联合诱发鸡原代肝细胞损伤,并藉此探索损伤机理以及复方甘草酸单铵(CAG)的保护作用。主要研究结果和内容如下:1 LPS联合恩诺沙星致鸡原代肝细胞损伤的最佳剂量和复方甘草酸单铵的保护剂量筛选采用改良的二步ⅣV型胶原酶灌流法,分离的鸡原代肝细胞,置于培养板培养48 h,细胞贴壁,之后在细胞中分别加入含0,30+40,30+60,30+80,30+100,30+120 μg/mL LPS和恩诺沙星(ENR)培养液(n=3)。继续培养24 h,光学显微镜观察细胞形态变化,MTT法测定细胞存活率。分离的鸡原代肝细胞培养48h后,先加入25,50,100,200和400μg/mL的复方甘草酸单胺(CAG)处理24 h,然后加入LPS+恩诺沙星,细胞培养液24 h,MTT法测定细胞存活率并收集各组细胞上清液,检测其中的ALT、AST的含量。结果显示:当LPS/ENR浓度为30+80μg/mL细胞存活率为(48.27±2.50)%,细胞形态不规则,细胞膜被破坏,而添加不同浓度的复方甘草酸单胺的肝细胞细胞活性明显升高,ALT和AST相应下降(P<0.05,P<0.01)。因此,我们选取30+80 μg/mL的LPS和ENR的浓度作为肝细胞损伤的最佳剂量,而复方甘草酸单胺的保护浓度为100,200,和400 μg/mL。2 LPS/恩诺沙星致鸡原代肝细胞损伤与氧化应激的关系采用改良的二步ⅣV型胶原酶灌流法,分离获得鸡原代肝细胞,置于培养板培养48 h,细胞贴壁,进行如下试验。对照组加入不含任何药物的培养液,损伤组加入30+80μg/mL的LPS/ENR,保护组预先加入25,50,100,200和400 μg/mL的复方甘草酸单胺处理24 h,再加入30+80 μg/mL的LPS/ENR处理24h。收集各组细胞,检测SOD,MDA,GSH,GSH-PX和ROS的含量。结果显示:与对照组相比,30+100μg/mL的LPS/ENR 可以使肝脏中的 SOD(P<0.01),GSH(P<0.01),GSH-PX(P<0.01)含量极显著下降,但添加CAG之后,这些指标均有所上升。而MDA(P<0.01)和ROS(P<0.01)极显著升高,CAG也可以使其含量下降。表明LPS/ENR可以通过氧化应激的方式使肝细胞发生损伤。3 LPS/恩诺沙星对鸡原代肝细胞凋亡方面的影响3.1 LPS/ENR对肝细胞凋亡的影响及复方甘草酸单胺的保护效应 对照组加入不含任何药物的培养液,损伤组加入30+80 μg/mL的LPS/ENR,保护组预先加入25,50,100,200和400 μg/mL的复方甘草酸单胺处理24 h,再加入30+80 μg/mL的LPS/ENR 处理 24h。收集细胞,用 Annexin V-FITC 和 PI 以及 Hoechst33342/PI 染色,用流式细胞仪检测和荧光显微镜进行观察。流式细胞计数仪结果可以看出,在LPS/ENR组,细胞凋亡率显著上升(P<0.01);而用CAG提前处理24h,肝细胞凋亡率随著CAG浓度的增加,细胞凋亡率显著下降(P<0.05,P<0.01)。荧光显微镜结果显示,在LPS/ENR组,细胞呈现高蓝色/低红色,并且比对照数量多,而CAG组基本与对照组相同。因此,LPS/ENR可能是通过促进鸡原代肝细胞凋亡的方式致鸡肝脏损伤。CAG预处理可以减少早期凋亡。3.2 线粒体膜电位的检测 线粒体膜电位下降一定程度上代表了早期的细胞凋亡,而线粒体膜电位下降是线粒体凋亡途径发生的一个重要标志。细胞按照上述方法处理并收集各组细胞,按照试剂盒说明书染色,在荧光显微镜下观察。结果表明,在模型组,线粒体膜电位下降。同样地,用CAG处理一定能够保护线粒体膜电位下降。3.3 观察细胞线粒体超微结构 同样按照上述分组处理细胞,收集各组细胞,PBS洗涤两遍,用2.5%戊二醛固定,制作电镜切片,通过透射电镜拍照观察。结果表明,对照组显示正常细胞的超微结构,包括完整细胞核,棒状线粒体。而用LPS/ENR处理组,肝细胞线粒体发生肿胀,线粒体内出现空泡,嵴间距变大。因此,提示我们LPS/ENR处理导致的肝损伤可能与线粒体途径有关。3.4 测定肝细胞中凋亡相关mRNA和蛋白表达量 试验分组如上述所示,提取RNA,通过 RT-PCR 测定 caspase-3,caspase-9,bax,bcl-2,cyt-c,jnk,p38 和 erk 的mRNA表达量。提取细胞总蛋白,通过Western blot技术测定caspase-3,caspase-9,cyt-c,jnk,p38,erk,p-jnk,p-p38 和p-erk 蛋白的表达量。结果表明,LPS/ENR 处理组 caspase-3(P<0.05),caspase-9(P<0.05),bax(P<0.01),cyt-c(P<0.01),jnk(P<0.01),p38(P<0.01)和erk(P<0.01)的mRNA表达量均显著上升,而加入不同浓度的CAG预处理24 h之后,相关mRNA表达量降低(P<0.05,P<0.01)。caspase-3,caspase-9,cyt-c,jnk,p38,erk,,p-jnk,p-p38 和 p-erk 蛋白表达变化和mRNA结果基本一致。表明LPS/ENR主要可能是通过线粒体途径和MAPKs途径来介导鸡肝细胞凋亡。