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研究背景与目的:睾丸中产生的成熟精子是男性生殖的前提。精子发生从精原细胞开始,是一个连续的过程,包括精原细胞的增殖,精母细胞的减数分裂以及精子形成三个阶段。在生理状态下,卵泡刺激素(Follicle-stimulating Hormone,FSH)促进精原细胞增殖并进入减数分裂;睾酮(Testosterone,T)维持减数分裂的完成以及精子形成,它们相互协同促进。除此之外,精子发生还受到其他激素以及睾丸局部调节因子的影响。对于睾丸局部调节机制,至今尚不完全清楚。精子形成是圆形精子细胞分化形成成熟精子,伴随着多余胞质的脱落以及核致密染色质的形成。在精子形成过程中,组蛋白H3、H4发生高度乙酰化使核染色质变得松散,组蛋白被过渡蛋白(Transition nuclear protein1/Transition nuclear protein2,Tnp1/Tnp2)替换下来,在睾丸特异性布罗莫结构域蛋白(bromodomaintestis-specific,BRDT)的诱导下被精子蛋白酶体或者其他蛋白水解机制所降解,过渡蛋白再被鱼精蛋白(Protamine1/Protamine2,Prm1/Prm 2)所替代,鱼精蛋白使得核染色质高度浓缩致密,从而避免精子头部的遗传物质被女性体内的有害物质所破坏,这是形成成熟精子非常关键的步骤。其中组蛋白乙酰化主要受组蛋白乙酰化酶(Histone acetyltransferases,HATs)以及组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)的调节,两者受睾丸内局部因子的调节。研究精子发生和精子形成的调节,对于深入理解男性不育症的发病机制具有重要意义。研究表明,半数以上男性不育症患者表现为少精子症、严重少精子症、弱精子或死精子症、畸形精子症,病因也大多不明确,其核心问题是精子发生障碍以及精子形成障碍。SET蛋白是一个多功能蛋白,在调节细胞周期中起重要作用,包括DNA复制、核小体装配、染色体修饰、DNA转录、细胞增殖、细胞凋亡等。其也被称作乙酰化酶抑制剂(inhibitor of acetyltransferases,INHAT),是INHAT复合物中的分子之一,能明显抑制组蛋白乙酰化。本课题前期研究发现SET蛋白主要表达于精原细胞,精母细胞,在精子细胞中有少量表达,并且SET蛋白能促进精原细胞增殖。因此我们认为,SET蛋白作为睾丸局部因子,参与调节精子发生和精子形成。为了证明以上假说,深入研究SET蛋白在精子发生和精子形成中的作用及其机制,本文采用小鼠精母细胞系GC-2 spd为模型,研究SET蛋白在精母细胞中的表达与定位;通过干涉SET的表达研究SET蛋白调节精母细胞增殖;进一步研究SET蛋白调节精子组蛋白乙酰化的作用。材料与方法:(1)体外培养GC-2 spd细胞,通过免疫荧光对精母细胞标志物乳酸脱氢酶C(lactate dehydrogenase C,LDHC)和睾丸特异激酶 1(Testis-Specific Kinase 1,TESK1)进行鉴定。(2)构建空载腺病毒(AdH1-siRNA/NS)和SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET),通过免疫荧光技术、实时定量逆转录聚合酶链反应(Realtime RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)等方法证明其干涉有效性。(3)分别将空载腺病毒(AdH1-siRNA/NS,对照组)和SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET,干涉组)转染至GC-2 spd细胞中,体外分别培养24h、48h、72h,用细胞计数的方法检测细胞增殖。(4)分别将腺病毒AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET转染至GC-2 spd细胞中,体外培养72h,用Western blot及RT-PCR方法检测组蛋白乙酰化水平、组蛋白乙酰化酶(HATs)以及组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的表达水平,用HAT活性试剂盒以及HDAC活性试剂盒检测HAT以及HDAC酶活性。(5)从体外培养的GC-2 spd细胞中提取蛋白质,用琼脂糖珠免疫共沉淀试剂盒检测SET蛋白与组蛋白H3、H4的结合。(6)统计学方法:SPSS 16.0软件进行统计学处理,数据以均数±标准差(Means±SD)表示。P<0.05为统计学有显著性差异。结果:(1)免疫荧光显示精母细胞株GC-2 spd阳性表达LDHC和TESK1。因此,GC-2 spd细胞系能被当作精母细胞在本实验中使用。(2)SET蛋白表达于GC-2 spd细胞的胞核和胞质中。AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET前期在本实验室已经构建。干涉SET后,胞核以及胞质中的SET蛋白均明显减少,细胞中SET蛋白表达量明显降低70～80%(P<0.01),表明构建的AdH1-siRNA/SET腺病毒是高效的。(3)干涉SET后,GC-2 spd细胞数明显降低(P<0.05),细胞增殖明显受到抑制。(4)干涉SET后,GC-2 spd的组蛋白H3、H4乙酰化水平明显增高2～3倍(P<0.05),但组蛋白乙酰化酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)的mRNA以及蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),它们的酶活性比值(HAT活性/HDAC活性)的差异也没有统计学意义(P>0.05)。(5)GC-2 spd细胞中的蛋白质免疫共沉淀结果提示GC-2 spd中SET蛋白与组蛋白H3、H4结合。结论:(1)SET蛋白在精母细胞核内和胞浆中均表达;敲除SET蛋白,抑制精母细胞增殖。提示SET蛋白通过促进精母细胞增殖参与调节精子发生。(2)SET蛋白抑制精子细胞组蛋白H3、H4乙酰化。SET蛋白通过结合组蛋白H3、H4,阻止其赖氨酸乙酰化位点的暴露,从而抑制H3、H4的乙酰化,进而可能抑制精子形成。(3)本研究证明,SET蛋白作为睾丸内的局部因子参与调节睾丸精子发生和精子形成。进一步阐明其作用机制,对于阐明男性不育症,尤其是男性少精症、弱精症、无精症、畸形精子症的病因机制具有重要的理论意义。