【摘 要】
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高纯度及具有生物活性的多肽/蛋白质是蛋白质分析、应用及生物技术发展的基础。因此开发出一种新型、高效、负载量大的固定化金属亲和色谱（Immobilized metal affinity chromatography,IMAC）固定相材料对于实现蛋白质的高效分离纯化有着重要意义。针对目前含组氨酸蛋白分离技术中IMAC固定相材料传质阻力较大、处理效率较低、缺乏有效的分离分析方法等问题,本课题以IMAC理
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2019YFD1002300）； 湖南省重点研发课题（2019NK2091）；
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高纯度及具有生物活性的多肽/蛋白质是蛋白质分析、应用及生物技术发展的基础。因此开发出一种新型、高效、负载量大的固定化金属亲和色谱（Immobilized metal affinity chromatography,IMAC）固定相材料对于实现蛋白质的高效分离纯化有着重要意义。针对目前含组氨酸蛋白分离技术中IMAC固定相材料传质阻力较大、处理效率较低、缺乏有效的分离分析方法等问题,本课题以IMAC理论为基础,设计并制备了具有高吸附量、重复利用性能好的新型Ni2+-S-TOCN/PVA复合气凝胶及分离效率高的S-TOCN/PVA@NiCoMnO4复合气凝胶两种功能化纳米纤维基复合气凝胶材料,将其作为IMAC分离介质,用于含组氨酸蛋白的分离纯化研究。主要研究内容如下:（1）以针叶木纤维纸浆为原料,为增加其表面的活性位点及比表面积,采用柠檬酸预处理、TEMPO-Na Br-Na Cl O催化氧化体系与超声处理相结合的方法制备了羧基纳米纤维素（TOCN）,羧基含量为1.40 mmol/g,得率为83.7%。为了得到能稳定螯合金属离子和负载金属氧化物的固定相材料,通过席夫碱反应将氨基硫脲接枝到TOCN表面得到氨基硫脲改性的纳米纤维素（S-TOCN）,用FTIR、XRD、SEM、TEM和TGA等一系列测试方法对TOCN和S-TOCN进行了表征和分析,结果表明成功制备了呈纤丝状、具有较高的长径比（20:1左右）且分散均匀的S-TOCN,为后续制备具有三维连通的多孔结构的S-TOCN/PVA复合气凝胶材料提供了基础。（2）纯的纳米纤维素材料通常具有较低的强度,通过加入PVA进行物理交联可以对其进行增强,采用液氮定向冷冻-冷冻干燥法制备出S-TOCN/PVA复合气凝胶,综合考虑其微观结构和力学性能,即既有相互连通的有取向的多孔结构,同时又具有良好的压缩性能,得到S-TOCN与PVA的最佳质量比为1:1。考察了S-TOCN/PVA复合气凝胶对不同Mn+的螯合能力及螯合上Mn+后的Mn+-S-TOCN/PVA复合气凝胶对杏仁水解蛋白中含组氨酸多肽的分离纯化效果,结果表明最佳螯合Mn+为Ni2+,经氨基硫脲改性后的S-TOCN与PVA制备得到的复合气凝胶对Ni2+的螯合量为83.66 mg/g,是改性前的2.7倍,且经Ni2+-S-TOCN/PVA复合气凝胶纯化后的含组氨酸多肽的富集倍数为4.81,与此同时,在洗脱液中未检测到Ni2+,说明螯合有Ni2+的S-TOCN/PVA复合气凝胶是理想的分离含组氨酸多肽的IMAC固定相材料。（3）采用共沉淀法制备了NiCoMnO4纳米粒子,并将其负载于S-TOCN/PVA复合气凝胶上制备了S-TOCN/PVA@NiCoMnO4复合气凝胶材料,SEM结果表明,当NiCoMnO4纳米粒子的添加量为20%时,其能很好的负载且均匀分散在S-TOCN/PVA复合气凝胶表面,有效的解决了NiCoMnO4纳米粒子团聚的问题。通过XRD、SEM、压缩性能测试、接触角测试和TGA等对其晶型结构、表面形貌、力学性能、润湿性和热稳定性等性能进行了表征和分析。并以S-TOCN/PVA@NiCoMnO4复合气凝胶材料作为IMAC固定相材料研究了其对血红蛋白（BHb）和牛血清蛋白（BSA）的亲和吸附性能,其对BHb的最大吸附容量为1970 mg/g,而对BSA的吸附量极低,表明S-TOCN/PVA@NiCoMnO4复合气凝胶对BHb具有良好的吸附特异性,是一类优异的血红蛋白分离介质,有望在实际的含组氨酸蛋白/多肽的分离纯化中得到应用。
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