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许多引起流产的传染性疾病对奶牛的繁殖和产奶造成严重损失,它们也是影响现代奶牛养殖业发展的重要因素。这些传染性疾病主要有布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻-粘膜病、弓形虫病和新孢子虫病等。本研究首先选定河北省8个大型奶牛场,从2004年3月至2006月2月采集流产奶牛血样、粪样以及流产胎儿病料共计536份,对其分别进行了布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻-粘膜病、弓形虫病和新孢子虫病的检测。采用血清学和细菌学诊断并结合临床症状对牛布病进行诊断,阳性率为5.2%;利用本是实验室建立的双抗体夹心ELISA方法检测牛病毒性腹泻-粘膜病,阳性率为31.3%:新孢子虫病应用ELISA法,N.caninum抗体阳性率为19.8%;弓形虫病使用IHA间接血凝检测方法,T.gondii抗体阳性率为1.7%:所有弓形虫抗体阳性血清中未检出新孢子虫抗体,所有新孢子虫抗体阳性血清中也未检出弓形虫抗体。在此基础上,本试验建立了诊断牛新孢子虫病的聚合酶链式反应技术。根据GenBank上已发表的新孢子虫Nc-5基因片段设计了一对特异性引物,用蛋白酶K法、盐析法和饱和酚/氯仿抽提法分别提取牛新孢子虫N.caninum抗体阳性血液的DNA并对其进行PCR扩增,经2%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增出长度约为350bp的片段。从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段,用DNA回收试剂盒回收目的片段,并使用限制性内切酶Msp Ⅰ进行酶切,酶切产物电泳检测结果表明,大小约为350bp的扩增片段被切成218bp和132bp两个片段,与预期结果相同。将回收产物与克隆载体pMD18-T连接,转化于用氯化钙制备的感受态细胞JM109,蓝白斑法筛选出阳性重组子。特异性引物对阳性克隆PCR鉴定结果和重组质粒DNA的酶切鉴定结果经1%琼脂糖电泳检测,均获得了与预期结果一致的脱氧核糖核酸片段。PCR特异性试验是对牛附红细胞体阳性血液,弓形虫抗体阳性血液,牛病毒性腹泻病毒阳性血液,牛新孢子虫N.caninum抗体阴性血液进行比较,结果均为阴性;PCR的敏感性试验证明最高稀释倍数可以达40倍,即模板DNA含量2.5mg/L,证明该PCR诊断技术具有较高的特异性和敏感性。应用本试验建立的PCR法对河北省8个大型奶牛场102份流产奶牛血样进行了检测,平均阳性率为19.6%,并对它们进行了弓形虫血清抗体的检测,所有阳性样品中未检出弓形虫抗体,证明该检测方法可以快速准确地对牛新孢子虫病作出诊断。