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肾脏纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病发展到后期的病理学改变,其本质是以细胞外基质过度积聚为特征的病理过程。Ⅰ型胶原在细胞外基质聚集中起着不可或缺的作用,其中编码为COL1A1的α1（I）起着主要的生物学作用。利用RNA干涉技术下调Ⅰ型胶原基因的过度表达,以期成为延缓肾脏纤维化的新方法。第一部分:人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA的设计筛选和鉴定目的:针对I型胶原α1（I）链设计并筛选人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA（COL1A1-siRNA）,并证实其有效性。方法:根据已知的设计原则,利用软件设计人鼠完全同源的一对Ⅰ型胶原siRNA序列。将非特异性带有荧光的siRNA转染至大鼠系膜细胞,显微镜下观察大鼠系膜细胞转染效率。直接将I型胶原siRNA转染至大鼠系膜细胞,利用RT-PCR的方法观察对大鼠系膜细胞I型胶原蛋白表达的抑制作用。结果:大鼠系膜细胞可以转染非特异性siRNAI型胶原,从而可以作为siRNA实验研究的载体,转染效率约为53.9%。将Ⅰ型胶原siRNA转染至大鼠系膜细胞,与空白对照组及MOCK组比较,各siRNA组均可见特异性513bp COL1A1基因条带,并随siRNA浓度增加,条带逐渐减暗。可见Ⅰ型胶原siRNA使Ⅰ型胶原表达下调,并具剂量依赖性。结论:所设计的Ⅰ型胶原siRNA为人与大鼠完全同源的siRNA序列,所有碱基完全匹配。可以成功转染到大鼠系膜细胞,并有效抑制I型胶原在细胞内的表达。第二部分人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA表达载体的构建目的:建立Ⅰ型胶原siRNA表达质粒,使其作用时间更长,表达更稳定。方法:将所确定的Ⅰ型胶原siRNA作为靶点,合成64 nt的寡核苷酸,经过退火、T4多聚核苷酸激酶处理,与经BamHⅠ和PstI酶切的线性化质粒pGPU6/GFP/Neo定向连接,转化至感受态细胞,并经过PCR和测序鉴定。将构建质粒转染至大鼠系膜细胞,RT-PCR观察抑制作用。结果:与空白对照组、mock组电泳条带比较,各siRNA质粒组均可见特异性513bp COL1A1基因条带,并随siRNA质粒浓度增加,条带逐渐减暗。可见Ⅰ型胶原siRNA质粒同样使Ⅰ型胶原表达下调,效果显著,并具剂量依赖性。结论:采用质粒载体的方法同样可以达到抑制Ⅰ型胶原形成的作用,而且表达更稳定,作用更显著。第三部分人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA对TGF-β1诱导Ⅰ型胶原表达的抑制作用目的:观察病理情况下Ⅰ型胶原siRNA对人TGF-β1诱导Ⅰ型胶原表达的抑制作用。方法:选用人TGF-β1诱导大鼠系膜细胞Ⅰ型胶原表达,观察表达效果。并利用Ⅰ型胶原siRNA质粒抑制其表达。结果:经TGF-β1诱导的I型胶原基因的表达明显增强,并随TGF-β1剂量的增大,效果更显著。经刺激因子TGF-β1诱导后,再转染Ⅰ型胶原siRNA质粒,可见与空白对照组、mock组比较,各刺激因子组条带逐渐增强,及单纯予以刺激因子诱导的相对应各组比较,转染siRNA组条带略减弱。结论:证实了所确定的siRNA载体在细胞实验中,针对I型胶原的特异性siRNA在病理状态下仍能有效抑制I型胶原基因增量调节后的过度表达水平,在强致病条件下仍能发挥其抑制作用。为今后的实验奠定了基础,可通过进一步在动物实验的研究中为减缓肾脏纤维化确立了较好的位点。