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[摘要] 目的 了解乳腺癌组织中人表皮生长因子受体2（HER-2）基因扩增与Her-2/neu蛋白表达的一致性与相关性。方法 采用荧光原位杂交（FISH）法及免疫组化（IHC）法分别检测349例浸润性乳腺癌患者的HER-2基因扩增与蛋白表达情况，分析二者检测结果的一致性与相关性。 结果FISH与IHC符合率为55.3 %，结果存在一致性（Kappa=0.189，P=0.000），呈正相关（r=0.434，P=0.000）。 结论 FISH与IHC两种检测结果存在一致性，但IHC（+～+++）患者均应以FISH检测作为评价HER-2基因是否扩增的标准方法。
[关键词] 乳腺癌；人表皮生长因子受体-2；荧光原位杂交；免疫组织化学
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）20-16-03
人表皮生长因子受体-2（HER-2）基因扩增与蛋白的过度表达提示该患者的内分泌治疗效果差，而应用曲妥珠单抗敏感性好[1-2]。目前指导临床治疗的常规检测方法为免疫组织化学（IHC）法和荧光原位杂交（FISH）法。本资料主要探讨IHC法HER-2蛋白表达与FISH法HER-2基因扩增的一致性与相关性，为临床应用曲妥珠单抗等药物提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2010年11月～2013年3月在泸州医学院附属医院病理科及2010年10月～2012年11月在四川省德阳市人民医院病理科进行IHC与FISH检测的349例患者，石蜡切片分别用于IHC与FISH检测。
1.2 试剂与探针
IHC检测使用基因科技（上海）有限公司抗体，ER克隆号：SP1；PR克隆号：SP2：erbB-2多克隆抗体；Ki-67克隆号：MIB-I.FISH，检测使用北京金普嘉公司HER-2基因扩增试剂盒。
1.3 方法
1.3.1 IHC技术 采用免疫组化envision法进行检测，Her-2蛋白棕色阳性定位于细胞膜。
1.3.2 FISH技术 按北京金普嘉公司Her-2基因扩增试剂盒说明书操作：（1）标本要求：2年以内的浸润性乳腺癌患者的石蜡包埋组织切片。新鲜标本取下后1h内放入10%中性福尔马林固定，用量为组织块的10倍以上，固定时间为6～48h；（2）老化玻片：切片厚3?m，置于干净的涂胶玻片，65℃烘烤过夜。（3）切片处理：常规脱蜡复水；高压锅抗原修复3min，冷却4min；37℃ 2×SSC液5min漂洗两次；37℃胃蛋白酶溶液（5?g/mL）+0.01mol/L HCL消化10～18min；37℃ 2×SSC液漂洗5min两次；乙醇梯度脱水后自然干燥玻片。（4）变性杂交：滴加10?L探针混合液覆盖组织，封片胶封闭盖玻片，于杂交仪中83℃变性8min，42℃杂交16h。（5）洗涤、判读：取出切片后去除封片胶，室温下于2×SSC液中浸泡使盖玻片自然脱落；46℃ 2×SSC漂洗10min；46℃ 0.1% NP40漂洗5min；室温70%乙醇浸泡4min；暗处自然干燥玻片后加10?L DAPI覆盖杂交区域并盖上盖玻片，暗处放置10～20min后荧光显微镜下观察。
1.4 结果判定标准
1.4.1 IHC结果判定 无着色者为（﹣）；任何比例的浸润癌细胞呈微弱、不完整的细胞膜着色者为（+）；>10%的浸润癌细胞呈微弱至中等强度、完整但不均匀的细胞膜棕黄着色者，或<30%的浸润癌细胞呈现强且完整的细胞膜棕褐着色；>30%的浸润癌细胞呈现强的、完整的细胞膜棕褐着色者为（+++）[3]。
1.4.2 FISH结果判定 （1）浸润癌区肿瘤细胞Her-2红信号明显成簇成团，判定为簇状扩增；（2）若不同于（1）的情况，计数30个细胞并计算Her-2红信号与着丝粒绿信号之比值，Ratio<1.8为阴性；Ratio>2.2为阳性；Ratio介于1.8～2.2之间时，增加计数细胞至100，若比值仍不变则判断为不确定[4]。
1.5 统计学方法
用SPSS11.5统计学分析软件分析，两种方法检测结果的一致性采用Kappa检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
IHC与FISH检测Her-2状态结果比较349例浸润性乳腺癌患者的病理标本中，FISH检测HER-2基因扩增率为28.08%（98/349）。5例病理标本重复制片并扩大计数后Ratio介于1.8～2.2之间，判定结果为可疑，2例2007年及2例2008年病理标本结果无法判读。IHC检测结果以阳性为主，Her-2/neu蛋白阳性（++～+++）率为69.91%（244/349）。IHC检测结果为（﹣/+）的病例中FISH检测扩增率为4.76%（5/105），IHC（++）的病例中扩增率为29.59%（50/169），IHC（+++）的病例中扩增率为57.33%（43/75）。一致性检验显示FISH与IHC一致率为55.3%，结果存在一致性（Kappa=0.189，P=0.000），两种检查结果呈正相关（r=0.434，P=0.000）。见表1。
3 讨论
针对乳腺癌的临床用药筛选，首先应对乳腺癌标本的ER、PR、HER-2、Ki-67等蛋白表达进行常规免疫组化检测。作为乳腺癌的靶向治疗筛选，HER-2的FISH检测不可替代。HER-2高表达或其基因的扩增与乳腺癌的发生、发展、预后及治疗等有着重要的联系[5-6]。HER-2基因扩增的乳腺癌患者对内分泌治疗及常规化疗药物不敏感、预后差，而对HER-2的靶向药物曲妥珠单抗的敏感性较好。曲妥珠单抗已通过美国FDA认证[7]，但必须由IHC（+++）时或FISH法检测结果为基因扩增时才能使用[8]。 本研究中，349例浸润性乳腺癌标本的FISH检测结果显示HER-2基因扩增率为28.08%（98/349），与某些国外报道基本一致[9-10]。IHC检测HER-2蛋白状态为（-/+）时，FISH检测HER-2基因扩增率为4.76%（5/105），两者符合性较好，与大多数文献报道一致[4，11]，提示IHC（-/+）时也应进一步行FISH检测进行筛查，避免遗漏部分HER-2蛋白状态为（-/+）但其HER-2基因扩增者的治疗；IHC（++）时的FISH检测HER-2基因扩增率为29.59%（50/169），与Heba AL-Khattabi[12]、李慧慧等[13]的报道相近，显示IHC（++）者应常规进行FISH检测，才能更加准确地指导临床选择治疗方案；IHC（+++）时FISH检测HER-2基因扩增率为57.33%（43/75），低于CM Ellis等[14]（90.0%）、Ghaffari等[11]（93.9%）、杜江等[15]（68.8%）的报道，此结果也是造成FISH与IHC相对符合率（55.3%）较低的主要原因，这最有可能与本次检测IHC（+++）的标本量较少（75例）有关，也不排除IHC本身的特点，如标本固定﹑抗原修复、抗体差异、操作技术及主观判读等因素的影响。本检测结果通过一致性检验显示FISH与IHC检测结果存在一致性，且呈正相关，与Kovács等[4]报道的一致，但其程度不及上述者，差异主要存在于IHC（+++）的情况。目前国内外推荐的用药筛选标准是先行IHC检测，若IHC（+++）者可直接进行靶向治疗。但从本次结果来看，IHC（+++）者有较大比率的HER-2基因无扩增。基于Mass等[16]报道了应用曲妥珠单抗治疗799例HER-2蛋白表达状态为（++）或（+++），但HER-2基因扩增状态不同的浸润性乳腺癌患者，结果显示有78%（596/765例）HER-2基因扩增患者应用曲妥珠单抗治疗的总有效率及长期生存率高于无基因扩增22%（169/765例）患者，可能提示IHC（+++）者再行FISH检测呈扩增者的预后将为更好。也有较多研究者支持应由FISH检测结果作为判断能否应用曲妥珠单抗治疗及预后的基本标准[11]，因此建议不论IHC（++）或（+++）者均应该进一步行FISH检测，一来可判断HER-2基因是否扩增，二来可预知即使是IHC（+++）者的预后情况。
总之，IHC（+～+++）乳腺癌患者的常规ER、PR、Her-2/neu、Ki-67免疫组化结果，可初步提供临床的治疗方案、预后判断及HER-2基因扩增等情况，但仍应以FISH检测方法作为评价HER-2基因是否扩增的标准方法。
[参考文献]
[1] Vogel CL，Cobleigh MA，Tripathy D，et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing netastatic breast cancer[J]. J Clin Oncol，2002，20（3）：719-726.
[2] Hye Jung Chang，Sae-Won Han，Do-Youn Oh，et al. Discordant human epidermal growth factor receptor 2 and hormone receptor status in primary and metastatic breast cancer and response to trastuzumab[J]. Jpn J Clin Oncol，2011，41（5）：593-599.
[3] 步宏，陈杰，付丽，等.乳腺癌HER2检测指南（2009版）[J].中华病理学杂志，2009，38（12）：836-840.
[4] Kovács A，Stenman G.HER2-testing in 538 consecutive breast cancer cases using FISH and immunohistochemistry[J]. Pathol Res Pract，2010，206（1）：39-42.
[5] 张文.乳腺癌HER2基因扩增显色原位杂交与免疫组化检测方法对比研究[J].中国医药科学，2013，3（5）：143-144.
[6] Jeffrey S. Ross，Elzbieta A. Slodkowska，W.Frasersymmans，et al. The HER-2 receptor and breast cancer：ten years of targeted anti–her-2 therapy and personalized medicine[J]. The Oncologist，2009，14（4）：320-368.
[7] Tariq M，Muniba A，Waseem I，et al. Status of HER-2 amplification，polysomy17 and histopathological features of 425 pakistani breast cancer patients[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2011，12（11）：3069-3073.
[8] Ramadan SS，Yapicier O，Kihtir S，et al. Correlation of HER 2/neu gene amplification with immunohistochemistry and other prognostic factors in breast carcinoma. [J]. Turk Patoloji Derg，2011，27（3）：196-203. [9] Zhang H，Ren G，Wang X，et al. HER-2 gene amplification by fluorescence in situ hybridization（FISH） compared with immunohistochemistry （IHC） in breast cancer： a study of 528 equivocal cases[J]. Breast Cancer Res Treat，2012，134（2）：743-749.
[10] I-Tien Yeh，MD. Measuring HER-2 in breast cancer： immunohistochemistry， FISH， or ELISA？ [J]. Am J Clin Pathol 2002，117（Suppl 1）：S26-S35.
[11] Ghaffari SR，Sabokbar T，Dastan J，et al. Her2 amplification status in Iranian breast cancer patients： comparison of immunohistochemistry（IHC） and fluorescence in situ hybridisation （FISH）[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2011，12（4）：1031-1034.
[12] Heba AL-Khattabi，Abdelhakeem Kelany，Abdelbaset Buhmeida，et al. Evaluation of HER-2/neu gene amplification by fluorescence in situ hybridization andimmunohistochemistry in saudi female breast cancer[J]. Anticancer Research，2010，30（10）：4081-4088.
[13] 李慧慧，马飞，曹瑄，等.乳腺癌HER2的表达与临床病理特征的关系[J].中华医学杂志，2011，91（2）：76-80.
[14] CM Ellis，MJ Dyson，TJ Stephenson，et al. HER2 amplification status in breast cancer： a compar ison between immuno histochemical staining and fluorescence in situ hybridisation using manual and autom ated quantitative image analysis scorin g techniques[J]. J Clin Pathol，2005，58（7）：710-714.
[15] 杜 江，刘小超，唐文婷，等.乳腺癌HER2基因荧光原位杂交及其临床病理关系[J].临床与实验病理学杂志，2010，26（1）：48-50.
[16] Mass R D，Press M F，Anderson S，et al. Evaluation of clinical outcomes according to HER2 detection by flurescence in situ hybridization in women with metastatic breast cancer treated with trastuzumab[J]. Clin Breast Cancer，2005，6（3）：240-246.
（收稿日期：2013-08-16）
[关键词] 乳腺癌；人表皮生长因子受体-2；荧光原位杂交；免疫组织化学
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）20-16-03
人表皮生长因子受体-2（HER-2）基因扩增与蛋白的过度表达提示该患者的内分泌治疗效果差，而应用曲妥珠单抗敏感性好[1-2]。目前指导临床治疗的常规检测方法为免疫组织化学（IHC）法和荧光原位杂交（FISH）法。本资料主要探讨IHC法HER-2蛋白表达与FISH法HER-2基因扩增的一致性与相关性，为临床应用曲妥珠单抗等药物提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2010年11月～2013年3月在泸州医学院附属医院病理科及2010年10月～2012年11月在四川省德阳市人民医院病理科进行IHC与FISH检测的349例患者，石蜡切片分别用于IHC与FISH检测。
1.2 试剂与探针
IHC检测使用基因科技（上海）有限公司抗体，ER克隆号：SP1；PR克隆号：SP2：erbB-2多克隆抗体；Ki-67克隆号：MIB-I.FISH，检测使用北京金普嘉公司HER-2基因扩增试剂盒。
1.3 方法
1.3.1 IHC技术 采用免疫组化envision法进行检测，Her-2蛋白棕色阳性定位于细胞膜。
1.3.2 FISH技术 按北京金普嘉公司Her-2基因扩增试剂盒说明书操作：（1）标本要求：2年以内的浸润性乳腺癌患者的石蜡包埋组织切片。新鲜标本取下后1h内放入10%中性福尔马林固定，用量为组织块的10倍以上，固定时间为6～48h；（2）老化玻片：切片厚3?m，置于干净的涂胶玻片，65℃烘烤过夜。（3）切片处理：常规脱蜡复水；高压锅抗原修复3min，冷却4min；37℃ 2×SSC液5min漂洗两次；37℃胃蛋白酶溶液（5?g/mL）+0.01mol/L HCL消化10～18min；37℃ 2×SSC液漂洗5min两次；乙醇梯度脱水后自然干燥玻片。（4）变性杂交：滴加10?L探针混合液覆盖组织，封片胶封闭盖玻片，于杂交仪中83℃变性8min，42℃杂交16h。（5）洗涤、判读：取出切片后去除封片胶，室温下于2×SSC液中浸泡使盖玻片自然脱落；46℃ 2×SSC漂洗10min；46℃ 0.1% NP40漂洗5min；室温70%乙醇浸泡4min；暗处自然干燥玻片后加10?L DAPI覆盖杂交区域并盖上盖玻片，暗处放置10～20min后荧光显微镜下观察。
1.4 结果判定标准
1.4.1 IHC结果判定 无着色者为（﹣）；任何比例的浸润癌细胞呈微弱、不完整的细胞膜着色者为（+）；>10%的浸润癌细胞呈微弱至中等强度、完整但不均匀的细胞膜棕黄着色者，或<30%的浸润癌细胞呈现强且完整的细胞膜棕褐着色；>30%的浸润癌细胞呈现强的、完整的细胞膜棕褐着色者为（+++）[3]。
1.4.2 FISH结果判定 （1）浸润癌区肿瘤细胞Her-2红信号明显成簇成团，判定为簇状扩增；（2）若不同于（1）的情况，计数30个细胞并计算Her-2红信号与着丝粒绿信号之比值，Ratio<1.8为阴性；Ratio>2.2为阳性；Ratio介于1.8～2.2之间时，增加计数细胞至100，若比值仍不变则判断为不确定[4]。
1.5 统计学方法
用SPSS11.5统计学分析软件分析，两种方法检测结果的一致性采用Kappa检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
IHC与FISH检测Her-2状态结果比较349例浸润性乳腺癌患者的病理标本中，FISH检测HER-2基因扩增率为28.08%（98/349）。5例病理标本重复制片并扩大计数后Ratio介于1.8～2.2之间，判定结果为可疑，2例2007年及2例2008年病理标本结果无法判读。IHC检测结果以阳性为主，Her-2/neu蛋白阳性（++～+++）率为69.91%（244/349）。IHC检测结果为（﹣/+）的病例中FISH检测扩增率为4.76%（5/105），IHC（++）的病例中扩增率为29.59%（50/169），IHC（+++）的病例中扩增率为57.33%（43/75）。一致性检验显示FISH与IHC一致率为55.3%，结果存在一致性（Kappa=0.189，P=0.000），两种检查结果呈正相关（r=0.434，P=0.000）。见表1。
3 讨论
针对乳腺癌的临床用药筛选，首先应对乳腺癌标本的ER、PR、HER-2、Ki-67等蛋白表达进行常规免疫组化检测。作为乳腺癌的靶向治疗筛选，HER-2的FISH检测不可替代。HER-2高表达或其基因的扩增与乳腺癌的发生、发展、预后及治疗等有着重要的联系[5-6]。HER-2基因扩增的乳腺癌患者对内分泌治疗及常规化疗药物不敏感、预后差，而对HER-2的靶向药物曲妥珠单抗的敏感性较好。曲妥珠单抗已通过美国FDA认证[7]，但必须由IHC（+++）时或FISH法检测结果为基因扩增时才能使用[8]。 本研究中，349例浸润性乳腺癌标本的FISH检测结果显示HER-2基因扩增率为28.08%（98/349），与某些国外报道基本一致[9-10]。IHC检测HER-2蛋白状态为（-/+）时，FISH检测HER-2基因扩增率为4.76%（5/105），两者符合性较好，与大多数文献报道一致[4，11]，提示IHC（-/+）时也应进一步行FISH检测进行筛查，避免遗漏部分HER-2蛋白状态为（-/+）但其HER-2基因扩增者的治疗；IHC（++）时的FISH检测HER-2基因扩增率为29.59%（50/169），与Heba AL-Khattabi[12]、李慧慧等[13]的报道相近，显示IHC（++）者应常规进行FISH检测，才能更加准确地指导临床选择治疗方案；IHC（+++）时FISH检测HER-2基因扩增率为57.33%（43/75），低于CM Ellis等[14]（90.0%）、Ghaffari等[11]（93.9%）、杜江等[15]（68.8%）的报道，此结果也是造成FISH与IHC相对符合率（55.3%）较低的主要原因，这最有可能与本次检测IHC（+++）的标本量较少（75例）有关，也不排除IHC本身的特点，如标本固定﹑抗原修复、抗体差异、操作技术及主观判读等因素的影响。本检测结果通过一致性检验显示FISH与IHC检测结果存在一致性，且呈正相关，与Kovács等[4]报道的一致，但其程度不及上述者，差异主要存在于IHC（+++）的情况。目前国内外推荐的用药筛选标准是先行IHC检测，若IHC（+++）者可直接进行靶向治疗。但从本次结果来看，IHC（+++）者有较大比率的HER-2基因无扩增。基于Mass等[16]报道了应用曲妥珠单抗治疗799例HER-2蛋白表达状态为（++）或（+++），但HER-2基因扩增状态不同的浸润性乳腺癌患者，结果显示有78%（596/765例）HER-2基因扩增患者应用曲妥珠单抗治疗的总有效率及长期生存率高于无基因扩增22%（169/765例）患者，可能提示IHC（+++）者再行FISH检测呈扩增者的预后将为更好。也有较多研究者支持应由FISH检测结果作为判断能否应用曲妥珠单抗治疗及预后的基本标准[11]，因此建议不论IHC（++）或（+++）者均应该进一步行FISH检测，一来可判断HER-2基因是否扩增，二来可预知即使是IHC（+++）者的预后情况。
总之，IHC（+～+++）乳腺癌患者的常规ER、PR、Her-2/neu、Ki-67免疫组化结果，可初步提供临床的治疗方案、预后判断及HER-2基因扩增等情况，但仍应以FISH检测方法作为评价HER-2基因是否扩增的标准方法。
[参考文献]
[1] Vogel CL，Cobleigh MA，Tripathy D，et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing netastatic breast cancer[J]. J Clin Oncol，2002，20（3）：719-726.
[2] Hye Jung Chang，Sae-Won Han，Do-Youn Oh，et al. Discordant human epidermal growth factor receptor 2 and hormone receptor status in primary and metastatic breast cancer and response to trastuzumab[J]. Jpn J Clin Oncol，2011，41（5）：593-599.
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[4] Kovács A，Stenman G.HER2-testing in 538 consecutive breast cancer cases using FISH and immunohistochemistry[J]. Pathol Res Pract，2010，206（1）：39-42.
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[6] Jeffrey S. Ross，Elzbieta A. Slodkowska，W.Frasersymmans，et al. The HER-2 receptor and breast cancer：ten years of targeted anti–her-2 therapy and personalized medicine[J]. The Oncologist，2009，14（4）：320-368.
[7] Tariq M，Muniba A，Waseem I，et al. Status of HER-2 amplification，polysomy17 and histopathological features of 425 pakistani breast cancer patients[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2011，12（11）：3069-3073.
[8] Ramadan SS，Yapicier O，Kihtir S，et al. Correlation of HER 2/neu gene amplification with immunohistochemistry and other prognostic factors in breast carcinoma. [J]. Turk Patoloji Derg，2011，27（3）：196-203. [9] Zhang H，Ren G，Wang X，et al. HER-2 gene amplification by fluorescence in situ hybridization（FISH） compared with immunohistochemistry （IHC） in breast cancer： a study of 528 equivocal cases[J]. Breast Cancer Res Treat，2012，134（2）：743-749.
[10] I-Tien Yeh，MD. Measuring HER-2 in breast cancer： immunohistochemistry， FISH， or ELISA？ [J]. Am J Clin Pathol 2002，117（Suppl 1）：S26-S35.
[11] Ghaffari SR，Sabokbar T，Dastan J，et al. Her2 amplification status in Iranian breast cancer patients： comparison of immunohistochemistry（IHC） and fluorescence in situ hybridisation （FISH）[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2011，12（4）：1031-1034.
[12] Heba AL-Khattabi，Abdelhakeem Kelany，Abdelbaset Buhmeida，et al. Evaluation of HER-2/neu gene amplification by fluorescence in situ hybridization andimmunohistochemistry in saudi female breast cancer[J]. Anticancer Research，2010，30（10）：4081-4088.
[13] 李慧慧，马飞，曹瑄，等.乳腺癌HER2的表达与临床病理特征的关系[J].中华医学杂志，2011，91（2）：76-80.
[14] CM Ellis，MJ Dyson，TJ Stephenson，et al. HER2 amplification status in breast cancer： a compar ison between immuno histochemical staining and fluorescence in situ hybridisation using manual and autom ated quantitative image analysis scorin g techniques[J]. J Clin Pathol，2005，58（7）：710-714.
[15] 杜 江，刘小超，唐文婷，等.乳腺癌HER2基因荧光原位杂交及其临床病理关系[J].临床与实验病理学杂志，2010，26（1）：48-50.
[16] Mass R D，Press M F，Anderson S，et al. Evaluation of clinical outcomes according to HER2 detection by flurescence in situ hybridization in women with metastatic breast cancer treated with trastuzumab[J]. Clin Breast Cancer，2005，6（3）：240-246.
（收稿日期：2013-08-16）