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[摘要] 目的 建立鼻咽清毒剂中龙胆苦苷的含量测定方法。 方法 采用HPLC法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水（25∶75）为流动相，检测波长270nm。 结果 龙胆苦苷在0.0822～0.822?g范围内线性关系良好，r=0.9999，平均回收率为98.7%，RSD为1.04%（n=6）。 结论 该方法简单易行，专属性和重视性良好，结果准确可靠，可用于其制剂的含量质量控制。
[关键词] HPLC法；鼻咽清毒剂；龙胆苦苷；含量测定
[中图分类号] R286 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）20-39-03
鼻咽清毒剂（颗粒）系卫生部药品标准中药成分制剂第七册收载品种，标准代号WS3-B-1453-93，由野菊花、苍耳子、重楼、两面针等八味药材经提取精制而成，具有清热解毒，消炎散结功能，在临床上用于鼻咽部慢性炎症，咽喉肿痛以及鼻咽癌放射治疗后分泌物增多等症治疗[1]。本品现行质量标准中，无含量测定项目，为了有效控制该产品质量，依据SFDA相关要求，在参考文献[2-12]的基础上，对其制剂龙胆苦苷含量进行了研究测定，结果表明，该方法可用于该制剂的质量控制。
1 材料与方法
1.1 仪器
Hi-Tech高效液相色谱仪（美国SSI公司）；Phenomenex ODS色谱柱（5?m，250mm×4.6mm ID）；SSI P4000泵；HW2000数据处理软件系统；Hi-Tech UV/Vis 500检测器。
1.2 试药
龙胆苦苷（批号0770-201006，供含量测定用），购自中国药品生物制品检定所。在选定色谱条件下分离，按归一化法计算，含量为99.31%。甲醇为色谱纯（上海陆中试剂厂）；水为二次蒸馏水；其他试剂均为分析纯。鼻咽清毒剂，自制。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex ODS柱（5?m，250mm×4.6mm ID）；流动相：甲醇-水（25∶75）；流速：1.0mL/min；检测波长：270nm；进样量：5?L；理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000。
1.3.2 对照品溶液的制备 取龙胆苦苷对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，用甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1毫升含龙胆苦苷对照品0.02mg）。
1.3.3 供试品溶液的制备 取本品5袋，精密称定，研细，取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇100mL，放置24h，时时振摇。滤过，精密吸取10mL，蒸干，残渣加流动相使溶解，移置10mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
1.3.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例和制剂工艺制备缺龙胆的阴性样品，再按供试品溶液项下方法，制得龙胆苦苷阴性对照溶液。
2 结果
2.1 系统适应性试验
分别精密吸取阴性对照溶液、供试品溶液、对照品溶液各5?L，注入液相色谱仪，测定，结果在龙胆苦苷吸收峰处，阴性对照无吸收，对测定结果无干扰，见图1。
2.2 线性关系考察
取龙胆苦苷对照品溶液0.3288mg/mL，用甲醇分别配成浓度为0.01644、0.03288、0.06576、0.013152和0.1644mg/mL，
的龙胆苦苷对照品溶液，在上述色谱条件下，分别进行测定，进样量5?L，记录色谱图，测定峰面积。以峰面积值（A）对进样量（M）作图，进行线性回归，得标准曲线方程为A=1443869.6M+7782.6，r=0.9999。结果表明，在0.0822～0.822?g范围内，龙胆苦苷峰面积值与进样量有良好的线性关系。
2.3 精密度试验
取配制好的供试品溶液（批号20120301），按拟定的色谱条件测定，重复进样5次，结果峰面积的RSD为0.93%，表明仪器精密度良好。
2.4 稳定性试验
取配制好的供试品溶液（批号20120301），按拟定色谱条件，分别在0、3、6、12和24h进样，测定峰面积值，结果RSD为1.08%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.5 重现性试验
按拟定的含量测定方法，取同一批样品（批号20120301）分别制备5份供试品溶液，测定龙胆苦苷的含量，结果RSD为1.95%，表明本品重现性良好。
2.6 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号20120301，龙胆苦苷含量2.12mg/袋）研细，取6份，每份5g，精密称定，置100mL量瓶中，分别加入浓度为0.3288mg/mL的龙胆苦苷对照品3、3、4、4、5和5mL，加甲醇至刻度，放置24h，时时振摇，滤过，精密量滤液10mL，蒸干，残渣加流动相使溶解，移置10mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45?m）滤过，按上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。结果RSD为1.04%，表明本方法加样回收率良好。
2.7 样品的测定
取10批样品，按拟定方法测定龙胆苦苷的含量，测定结果为2.12、2.18、2.32、2.44、2.14、1.88、2.72、1.82、1.68和2.26mg/袋，平均含量为2.16mg/袋。
3 讨论
3.1 提取完全性试验
本文曾对供试品用甲醇超声提取，结果样品杂质峰较多，龙胆苦苷峰分离度低。亦使用大孔吸附树脂柱对供试品进行分离，结果使龙胆苦苷含量降低。最后参考《中国药典》2010年版一部龙胆项下的龙胆苦苷含量测定方法，所得龙胆苦苷峰分离度较好，杂质峰相对较少，且含量较前两种方法高，因此确定此法作为供试品溶液的处理方法。 3.2 静置时间考察
取本品，研细，取四份，每份约10g，精密称定，分别置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，放置6、12、24和36h，时时振摇，滤过，精密量取滤液10mL，蒸干，残渣加流动相使溶解，移置10mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用0.45?m微孔滤膜滤过，即得。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5?L，注入液相色谱仪，测定，计算，结果表明，静置24h，含量趋于稳定，故确定本品静置时间为24h。
3.3 龙胆药材中龙胆苦苷含量考察
为了控制和保证制剂的质量，采用与制剂相同的测定方法，对三个不同产地龙胆中龙胆苦苷的含量进行测定，结果三地龙胆的龙胆苦苷含量分别为1.08，1.25和1.19%，根据测定结果，考虑到药材产地，加工炮制、贮藏等因素，暂定龙胆药材中龙胆苦苷含量不低于1.0%。
[参考文献]
[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部药品标准·中药成分制剂[S].第7册.1993：192.
[2]国家食品药品监督管理局.局令28号药品注册管理办法[S].2007：10.
[3] 国家食品药品监督管理局.药物研究技术指导原则（2005）[M].中国医药科技出版社，2005：196.
[4] 国家药典委员会.中国药典2010年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：205.
[5] 国家药典委员会.中国药典一部[S].2010：89.
[6] 李延雪，王云龙，邵礼梅.高效液相色谱法同时测定耳聋通窍丸中龙胆苦苷和栀子苷含量[J].中国药业，2012（20）：45.
[7] 谢瑞萍. HPLC法测定复方龙胆片中龙胆苦苷的含量[J].云南中医中药杂志，2011（7）：74.
[8] 李晓燕，许红辉，张彦芬，等.龙荟胶囊中龙胆苦苷和栀子苷同时测定研究[J].中成药，2008（6）：861.
[9] 刘少文. 高效液相色谱法测定龙胆中龙胆苦苷的含量[J]. 中国当代医药，2011，48（3）：11.
[10] 宋愿智，姜华，唐永红. HPLC法测定耳聋通窍丸中龙胆苦苷的含量[J]. 西北药学杂志，2010（3）：168.
[11] 王艳君，尹宗明，陈珍珊. HPLC法测定秦川通痹胶囊中龙胆苦苷的含量[J].中国药品标准，2007（1）：47.
[12] 罗晨曲，吕情花，彭建军，等. HPLC法测定强肝胶囊中龙胆苦苷的含量[J].中国药房，2008（36）：2849.
（收稿日期：2013-08-19）
[关键词] HPLC法；鼻咽清毒剂；龙胆苦苷；含量测定
[中图分类号] R286 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）20-39-03
鼻咽清毒剂（颗粒）系卫生部药品标准中药成分制剂第七册收载品种，标准代号WS3-B-1453-93，由野菊花、苍耳子、重楼、两面针等八味药材经提取精制而成，具有清热解毒，消炎散结功能，在临床上用于鼻咽部慢性炎症，咽喉肿痛以及鼻咽癌放射治疗后分泌物增多等症治疗[1]。本品现行质量标准中，无含量测定项目，为了有效控制该产品质量，依据SFDA相关要求，在参考文献[2-12]的基础上，对其制剂龙胆苦苷含量进行了研究测定，结果表明，该方法可用于该制剂的质量控制。
1 材料与方法
1.1 仪器
Hi-Tech高效液相色谱仪（美国SSI公司）；Phenomenex ODS色谱柱（5?m，250mm×4.6mm ID）；SSI P4000泵；HW2000数据处理软件系统；Hi-Tech UV/Vis 500检测器。
1.2 试药
龙胆苦苷（批号0770-201006，供含量测定用），购自中国药品生物制品检定所。在选定色谱条件下分离，按归一化法计算，含量为99.31%。甲醇为色谱纯（上海陆中试剂厂）；水为二次蒸馏水；其他试剂均为分析纯。鼻咽清毒剂，自制。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex ODS柱（5?m，250mm×4.6mm ID）；流动相：甲醇-水（25∶75）；流速：1.0mL/min；检测波长：270nm；进样量：5?L；理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000。
1.3.2 对照品溶液的制备 取龙胆苦苷对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，用甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1毫升含龙胆苦苷对照品0.02mg）。
1.3.3 供试品溶液的制备 取本品5袋，精密称定，研细，取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇100mL，放置24h，时时振摇。滤过，精密吸取10mL，蒸干，残渣加流动相使溶解，移置10mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
1.3.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例和制剂工艺制备缺龙胆的阴性样品，再按供试品溶液项下方法，制得龙胆苦苷阴性对照溶液。
2 结果
2.1 系统适应性试验
分别精密吸取阴性对照溶液、供试品溶液、对照品溶液各5?L，注入液相色谱仪，测定，结果在龙胆苦苷吸收峰处，阴性对照无吸收，对测定结果无干扰，见图1。
2.2 线性关系考察
取龙胆苦苷对照品溶液0.3288mg/mL，用甲醇分别配成浓度为0.01644、0.03288、0.06576、0.013152和0.1644mg/mL，
的龙胆苦苷对照品溶液，在上述色谱条件下，分别进行测定，进样量5?L，记录色谱图，测定峰面积。以峰面积值（A）对进样量（M）作图，进行线性回归，得标准曲线方程为A=1443869.6M+7782.6，r=0.9999。结果表明，在0.0822～0.822?g范围内，龙胆苦苷峰面积值与进样量有良好的线性关系。
2.3 精密度试验
取配制好的供试品溶液（批号20120301），按拟定的色谱条件测定，重复进样5次，结果峰面积的RSD为0.93%，表明仪器精密度良好。
2.4 稳定性试验
取配制好的供试品溶液（批号20120301），按拟定色谱条件，分别在0、3、6、12和24h进样，测定峰面积值，结果RSD为1.08%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.5 重现性试验
按拟定的含量测定方法，取同一批样品（批号20120301）分别制备5份供试品溶液，测定龙胆苦苷的含量，结果RSD为1.95%，表明本品重现性良好。
2.6 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号20120301，龙胆苦苷含量2.12mg/袋）研细，取6份，每份5g，精密称定，置100mL量瓶中，分别加入浓度为0.3288mg/mL的龙胆苦苷对照品3、3、4、4、5和5mL，加甲醇至刻度，放置24h，时时振摇，滤过，精密量滤液10mL，蒸干，残渣加流动相使溶解，移置10mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45?m）滤过，按上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。结果RSD为1.04%，表明本方法加样回收率良好。
2.7 样品的测定
取10批样品，按拟定方法测定龙胆苦苷的含量，测定结果为2.12、2.18、2.32、2.44、2.14、1.88、2.72、1.82、1.68和2.26mg/袋，平均含量为2.16mg/袋。
3 讨论
3.1 提取完全性试验
本文曾对供试品用甲醇超声提取，结果样品杂质峰较多，龙胆苦苷峰分离度低。亦使用大孔吸附树脂柱对供试品进行分离，结果使龙胆苦苷含量降低。最后参考《中国药典》2010年版一部龙胆项下的龙胆苦苷含量测定方法，所得龙胆苦苷峰分离度较好，杂质峰相对较少，且含量较前两种方法高，因此确定此法作为供试品溶液的处理方法。 3.2 静置时间考察
取本品，研细，取四份，每份约10g，精密称定，分别置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，放置6、12、24和36h，时时振摇，滤过，精密量取滤液10mL，蒸干，残渣加流动相使溶解，移置10mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用0.45?m微孔滤膜滤过，即得。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5?L，注入液相色谱仪，测定，计算，结果表明，静置24h，含量趋于稳定，故确定本品静置时间为24h。
3.3 龙胆药材中龙胆苦苷含量考察
为了控制和保证制剂的质量，采用与制剂相同的测定方法，对三个不同产地龙胆中龙胆苦苷的含量进行测定，结果三地龙胆的龙胆苦苷含量分别为1.08，1.25和1.19%，根据测定结果，考虑到药材产地，加工炮制、贮藏等因素，暂定龙胆药材中龙胆苦苷含量不低于1.0%。
[参考文献]
[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部药品标准·中药成分制剂[S].第7册.1993：192.
[2]国家食品药品监督管理局.局令28号药品注册管理办法[S].2007：10.
[3] 国家食品药品监督管理局.药物研究技术指导原则（2005）[M].中国医药科技出版社，2005：196.
[4] 国家药典委员会.中国药典2010年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：205.
[5] 国家药典委员会.中国药典一部[S].2010：89.
[6] 李延雪，王云龙，邵礼梅.高效液相色谱法同时测定耳聋通窍丸中龙胆苦苷和栀子苷含量[J].中国药业，2012（20）：45.
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[8] 李晓燕，许红辉，张彦芬，等.龙荟胶囊中龙胆苦苷和栀子苷同时测定研究[J].中成药，2008（6）：861.
[9] 刘少文. 高效液相色谱法测定龙胆中龙胆苦苷的含量[J]. 中国当代医药，2011，48（3）：11.
[10] 宋愿智，姜华，唐永红. HPLC法测定耳聋通窍丸中龙胆苦苷的含量[J]. 西北药学杂志，2010（3）：168.
[11] 王艳君，尹宗明，陈珍珊. HPLC法测定秦川通痹胶囊中龙胆苦苷的含量[J].中国药品标准，2007（1）：47.
[12] 罗晨曲，吕情花，彭建军，等. HPLC法测定强肝胶囊中龙胆苦苷的含量[J].中国药房，2008（36）：2849.
（收稿日期：2013-08-19）