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[摘要] 目的 建立高效液相色谱-质谱联用测定甲磺酸伊马替尼中基因毒性杂质伊马胺的方法。 方法 选用C18色谱柱（3.5μm，150mm×3.0mm），以0.05%甲酸的乙腈-20mmol/L甲酸铵为流动相，采用梯度洗脱进行分离，流速：0.5mL/min；柱温为40℃；进样量10μL。对照品溶液选用TSQ Quantum Ultra质谱仪的选择离子检测（SIM）扫描方式进行检测。 结果 该方法在2.5～100.0ng/mL范围内线性良好（0.998），定量限和检出限分别为2.5ng/mL和1.0ng/mL，方法回收率97.1%，稳定性较好。 结论 本研究所建立的方法快速、灵敏、专属性强，适用于甲磺酸伊马替尼中基因毒性杂质伊马胺的测定。
[关键词] 甲磺酸伊马替尼；LC-MS/MS；基因毒性杂质；伊马胺
[中图分类号] R927 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）20-36-03
甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate）是瑞士Novartis公司研发的Bcr-Abl酪氨酸激酶受体抑制剂，2001年首次在美国上市[1]，商品名Gleevec。临床主要用于治疗慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）急变期[2-3]、加速期或α-干扰素治疗失败后的慢性期患者和治疗不能切除和发生转移的恶性胃肠道间质肿瘤（GIST）的成人患者[4]，治疗效果得到了广泛的认可。伊马胺化学名N-（5-氨基-2-甲基苯基）-4-（3-吡啶基）-2-嘧啶胺是合成甲磺酸伊马替尼合成的中间体[5-7]，属于潜在的基因毒性杂质[8-9]。根据美国食品和药物管理局（FDA）和国际药品注册协调会议（ICH）关于基因毒性杂质的指导原则要求[10-11]，本资料拟建立采用LC-MS/MS测定本品合成中间体伊马胺的含量方法。
1 仪器与试剂
仪器：XS105电子分析天平（瑞士METTLER公司）；UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）；TSQ Quantum Ultra三重四级杆串联质谱仪，配有电喷雾离子源（美国Thermo Scientific公司）。
试剂：甲酸（色谱纯，Fluka公司）；乙腈（色谱纯，Fisher公司）；甲酸胺（色谱纯，上海安谱科学仪器公司）；超纯水（屈臣氏）；伊马胺（含量99.7%，本公司自制）。
2 方法与结果
2.1 色谱-质谱条件
色谱条件：照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录ⅤD），用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲酸铵缓冲液（取甲酸铵1.26g，加水1000mL溶解后，用甲酸调节pH值至3.4～3.5）为流动相A，含有0.05%甲酸的乙腈为流动相B；流速为0.5mL/min，梯度洗脱程序t：0-6-10-15-15.1-25min，流动相比例B%：20%-20%-80%-80%-20%-20%，柱温为40℃，进样量为10μL。
质谱条件：电喷雾（ESI）电离源，正离子方式检测；喷雾电压：3.0kV；气化温度：300℃；鞘气（N2）压力：30arb；辅助气（N2）压力：5arb；离子传输管温度：300℃；扫描方式为选择离子检测（SIM），用于定量分析的检测离子为m/z：277.8。
2.2 溶液配制
2.2.1 供试品溶液 取甲磺酸伊马替尼适量，精密称定，用水-乙腈（70︰30）溶解并定量稀释制成每毫升中约含5mg的溶液，作为供试品溶液。
2.2.2 对照品储备液 取伊马胺对照品约25mg，精密称定，用水-乙腈（70︰30）溶解并定量稀释成每毫升中约含500ng的溶液摇匀，作为对照品储备溶液。
2.3 分析方法确证
2.3.1 质谱分析 将对照品溶液采用蠕动泵进样模式，进行全扫描（full scan）形式分析检测，相应的质谱图见图1。
胺对照品溶液的选择离子扫描质谱图
2.3.2 方法的专属性 在所确定的2.1色谱-质谱条件下，对空白溶液（水-乙腈=70︰30）和伊马胺对照溶液100ng/mL，）进行检测，考察方法的专属性，色谱图见图2。结果表明：在2.1色谱-质谱条件下，空白溶液不干扰伊马胺杂质的检测，专属性良好。
2.3.3 线性关系考察 精密量取伊马胺对照品储备液0.25、0.5、1、5、10mL置50mL量瓶中，用稀释液稀释定容至刻度，分别配制成浓度为2.5、5、10、50、100ng/mL的溶液，精密量取上述溶液各10μL，分别注入液相色谱质谱仪中，采用2.1确定的色谱-质谱条件检测，记录色谱图，量取峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，线性回归方程为：A=146470600×C-221088，r=0.998，说明本品在2.5～10ng/mL范围内线性良好。测定结果见下表1。
2.3.4 定量限与检测限 在2.3.3试验条件下，配制不同浓度伊马胺对照品，检测限以S/N≥3计，定量限以S/N≥10计，分别进样确定伊马胺的检测限和定量限，实验结果见下表2。
2.3.5 方法准确度 称取甲磺酸伊马替尼约125mg，置25mL量瓶中，作为回收率基质样品；称取伊马胺约25mg，置50mL的量瓶中，用水-乙腈（70︰30）溶解并稀释定容至刻度，摇匀，精密量取该溶液1.0mL置100mL量瓶中，用水-乙腈（70︰30）稀释至刻度，精密量取该溶液1.0mL置100mL量瓶中，用水-乙腈（70︰30）稀释至刻度作为伊马胺杂质溶液。以伊马胺的含量（0.0002%基质样品浓度）为基准100%，分别精密量取伊马胺杂质溶液2.5、5.0、10.0mL分别置于盛有基质样品的25mL量瓶中，混匀，用水-乙腈（70︰30）稀释定容，配制成含伊马胺杂质50%、100%、200%的溶液，同法平行3次，作为供试品溶液。 精密量取上述溶液各10μL，分别注入液相色谱质谱仪中，采用2.1确定的色谱-质谱条件检测，记录色谱图，量取峰面积（其中供试品中伊马胺的峰面积需扣除样品基质中伊马胺的峰面积），计算回收率，实验结果见表3。
从上述系列表可以看出，伊马胺测定平均回收率为97.1%，RSD为3.75%（n=9），表明该方法检测伊马胺的准确度很好。
3 结论
采用LC-MS/MS法测定药物中的基因毒性杂质具有选择性好，灵敏度高的优点，目前正越来越多的应用于新药研发中遗传毒性杂质的分析中[12-14]。基于伊马胺为甲磺酸伊马替尼为合成中间体同时也是潜在的降解产物，该杂质可能具有基因毒性含量低（小于2ppm），因而对其检测方法提出了更高的要求。应用单一的HPLC方法[15]，采用紫外检测器最低的检测限度为20ppm，而采用液质联用技术，以选择
离子检测（SIM）监测方式扫描检测，具有极高的灵敏度，最低检测限度可达到0.2ppm，该检测方法简单、快速、方法灵敏度和准确度高，实用性强，为相关的药品检测工作提供了快速准确的技术支持，可为药品安全，保证人体健康提供技术保障。
[参考文献]
[1] Cohen MH，Williams G，Johnson JR，et al.Approval summary for imatinib mesylate capsules in the treatment of chronic myelogenous leukemia[J].Clin Cancer Res，2002，8（5）：935-942.
[2] 郑斌，危晴岚，刘茂柏，等.甲磺酸伊马替尼临床研究概况[J].海峡药学，2006，18（6）：78-80.
[3] 吴荣娟，马旭东.甲磺酸伊马替尼的耐药机制及逆转策略[J].医学综述，2011，17（22）：3460-3463.
[4] 王晨.甲磺酸伊马替尼抗肿瘤作用研究[J].天津药学，2005，17（4）：63-65.
[5] 陈敖，黄荷香，宋帅娟，等.甲磺酸伊马替尼的合成[J].精细与专用化学品，2007，15（8）：23-25.
[6] 王保国，刘玉凤，狄国杰，等.甲磺酸伊马替尼的合成[J].济宁医学院学报，2012，35（2）：100-102.
[7] 付利强，王鹏，程卯生，等.甲磺酸伊马替尼合成路线图解[J].中国医药工业杂质，2008，39（10）：786-787.
[8] 王棋，宋锐，费梦莹，等.梯度洗脱HPLC法测定甲磺酸伊马替尼的含量及有关物质[J].海峡药学，2012，24（3）：58-60.
[9] Giordani A，Kobel W，Gally HU. Overall impact of the regulatory requirements for genotoxic impurities on the drug development process[J].Eur J Pharm Sci，2011，43（1-2）：1-15.
[10] Raman NVVSS，Prasad AVSS，Reddy KR. Strategies for the identification， control and determination ofgenotoxic impurities in drug substance：A pharmaceutical industryperspective [J].J Pharm Biomed Anal，2011，55（4）：662-667.
[11] 张园园，李银峰，王杰晶，等.药物中痕量磺酸酯类物质的检测技术研究进展[J].药物评价研究，2012，35（4）：304-306.
[12] Kakadiya PR，Reddy BP，Singh V，et al.Low level determinations of methyl methanesulfonate and ethyl methanesulfonate impurities in Lopinavir and Ritonavir active pharmaceutical ingredients by LC/MS/MS using electrospray ionization[J].J Pharm Biomed Anal，2011，55（2）：379-384.
[13] Montesano MA，Whitehead JRD，Jayatilaka NK，et al. Measurement of methyl methanesulfonate in humaan plasma and breast milk samples using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-tandem mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2010，52（2）：260-264.
[14] An V，Sun M，Bai L，et al. A practical derivatization LC/MS approach for determination of trace level alkyl sulfonates and dialkyl sulfates genotoxic impurities in drug substances [J].J Pharm Biomed Anal， 2008，48（3）：1006-1010.
[15] Oostendorp RL，Beijnen JH，Schellensi HM，et al. Determination of imatinib mesylate and its main metabolite （cgp74588） in human plasma and murine specimens by ion-pairing reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].Biomed Chromatogr Published Online，2007，27（3）：34-36.
（收稿日期：2013-07-12）
[关键词] 甲磺酸伊马替尼；LC-MS/MS；基因毒性杂质；伊马胺
[中图分类号] R927 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）20-36-03
甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate）是瑞士Novartis公司研发的Bcr-Abl酪氨酸激酶受体抑制剂，2001年首次在美国上市[1]，商品名Gleevec。临床主要用于治疗慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）急变期[2-3]、加速期或α-干扰素治疗失败后的慢性期患者和治疗不能切除和发生转移的恶性胃肠道间质肿瘤（GIST）的成人患者[4]，治疗效果得到了广泛的认可。伊马胺化学名N-（5-氨基-2-甲基苯基）-4-（3-吡啶基）-2-嘧啶胺是合成甲磺酸伊马替尼合成的中间体[5-7]，属于潜在的基因毒性杂质[8-9]。根据美国食品和药物管理局（FDA）和国际药品注册协调会议（ICH）关于基因毒性杂质的指导原则要求[10-11]，本资料拟建立采用LC-MS/MS测定本品合成中间体伊马胺的含量方法。
1 仪器与试剂
仪器：XS105电子分析天平（瑞士METTLER公司）；UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）；TSQ Quantum Ultra三重四级杆串联质谱仪，配有电喷雾离子源（美国Thermo Scientific公司）。
试剂：甲酸（色谱纯，Fluka公司）；乙腈（色谱纯，Fisher公司）；甲酸胺（色谱纯，上海安谱科学仪器公司）；超纯水（屈臣氏）；伊马胺（含量99.7%，本公司自制）。
2 方法与结果
2.1 色谱-质谱条件
色谱条件：照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录ⅤD），用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲酸铵缓冲液（取甲酸铵1.26g，加水1000mL溶解后，用甲酸调节pH值至3.4～3.5）为流动相A，含有0.05%甲酸的乙腈为流动相B；流速为0.5mL/min，梯度洗脱程序t：0-6-10-15-15.1-25min，流动相比例B%：20%-20%-80%-80%-20%-20%，柱温为40℃，进样量为10μL。
质谱条件：电喷雾（ESI）电离源，正离子方式检测；喷雾电压：3.0kV；气化温度：300℃；鞘气（N2）压力：30arb；辅助气（N2）压力：5arb；离子传输管温度：300℃；扫描方式为选择离子检测（SIM），用于定量分析的检测离子为m/z：277.8。
2.2 溶液配制
2.2.1 供试品溶液 取甲磺酸伊马替尼适量，精密称定，用水-乙腈（70︰30）溶解并定量稀释制成每毫升中约含5mg的溶液，作为供试品溶液。
2.2.2 对照品储备液 取伊马胺对照品约25mg，精密称定，用水-乙腈（70︰30）溶解并定量稀释成每毫升中约含500ng的溶液摇匀，作为对照品储备溶液。
2.3 分析方法确证
2.3.1 质谱分析 将对照品溶液采用蠕动泵进样模式，进行全扫描（full scan）形式分析检测，相应的质谱图见图1。
胺对照品溶液的选择离子扫描质谱图
2.3.2 方法的专属性 在所确定的2.1色谱-质谱条件下，对空白溶液（水-乙腈=70︰30）和伊马胺对照溶液100ng/mL，）进行检测，考察方法的专属性，色谱图见图2。结果表明：在2.1色谱-质谱条件下，空白溶液不干扰伊马胺杂质的检测，专属性良好。
2.3.3 线性关系考察 精密量取伊马胺对照品储备液0.25、0.5、1、5、10mL置50mL量瓶中，用稀释液稀释定容至刻度，分别配制成浓度为2.5、5、10、50、100ng/mL的溶液，精密量取上述溶液各10μL，分别注入液相色谱质谱仪中，采用2.1确定的色谱-质谱条件检测，记录色谱图，量取峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，线性回归方程为：A=146470600×C-221088，r=0.998，说明本品在2.5～10ng/mL范围内线性良好。测定结果见下表1。
2.3.4 定量限与检测限 在2.3.3试验条件下，配制不同浓度伊马胺对照品，检测限以S/N≥3计，定量限以S/N≥10计，分别进样确定伊马胺的检测限和定量限，实验结果见下表2。
2.3.5 方法准确度 称取甲磺酸伊马替尼约125mg，置25mL量瓶中，作为回收率基质样品；称取伊马胺约25mg，置50mL的量瓶中，用水-乙腈（70︰30）溶解并稀释定容至刻度，摇匀，精密量取该溶液1.0mL置100mL量瓶中，用水-乙腈（70︰30）稀释至刻度，精密量取该溶液1.0mL置100mL量瓶中，用水-乙腈（70︰30）稀释至刻度作为伊马胺杂质溶液。以伊马胺的含量（0.0002%基质样品浓度）为基准100%，分别精密量取伊马胺杂质溶液2.5、5.0、10.0mL分别置于盛有基质样品的25mL量瓶中，混匀，用水-乙腈（70︰30）稀释定容，配制成含伊马胺杂质50%、100%、200%的溶液，同法平行3次，作为供试品溶液。 精密量取上述溶液各10μL，分别注入液相色谱质谱仪中，采用2.1确定的色谱-质谱条件检测，记录色谱图，量取峰面积（其中供试品中伊马胺的峰面积需扣除样品基质中伊马胺的峰面积），计算回收率，实验结果见表3。
从上述系列表可以看出，伊马胺测定平均回收率为97.1%，RSD为3.75%（n=9），表明该方法检测伊马胺的准确度很好。
3 结论
采用LC-MS/MS法测定药物中的基因毒性杂质具有选择性好，灵敏度高的优点，目前正越来越多的应用于新药研发中遗传毒性杂质的分析中[12-14]。基于伊马胺为甲磺酸伊马替尼为合成中间体同时也是潜在的降解产物，该杂质可能具有基因毒性含量低（小于2ppm），因而对其检测方法提出了更高的要求。应用单一的HPLC方法[15]，采用紫外检测器最低的检测限度为20ppm，而采用液质联用技术，以选择
离子检测（SIM）监测方式扫描检测，具有极高的灵敏度，最低检测限度可达到0.2ppm，该检测方法简单、快速、方法灵敏度和准确度高，实用性强，为相关的药品检测工作提供了快速准确的技术支持，可为药品安全，保证人体健康提供技术保障。
[参考文献]
[1] Cohen MH，Williams G，Johnson JR，et al.Approval summary for imatinib mesylate capsules in the treatment of chronic myelogenous leukemia[J].Clin Cancer Res，2002，8（5）：935-942.
[2] 郑斌，危晴岚，刘茂柏，等.甲磺酸伊马替尼临床研究概况[J].海峡药学，2006，18（6）：78-80.
[3] 吴荣娟，马旭东.甲磺酸伊马替尼的耐药机制及逆转策略[J].医学综述，2011，17（22）：3460-3463.
[4] 王晨.甲磺酸伊马替尼抗肿瘤作用研究[J].天津药学，2005，17（4）：63-65.
[5] 陈敖，黄荷香，宋帅娟，等.甲磺酸伊马替尼的合成[J].精细与专用化学品，2007，15（8）：23-25.
[6] 王保国，刘玉凤，狄国杰，等.甲磺酸伊马替尼的合成[J].济宁医学院学报，2012，35（2）：100-102.
[7] 付利强，王鹏，程卯生，等.甲磺酸伊马替尼合成路线图解[J].中国医药工业杂质，2008，39（10）：786-787.
[8] 王棋，宋锐，费梦莹，等.梯度洗脱HPLC法测定甲磺酸伊马替尼的含量及有关物质[J].海峡药学，2012，24（3）：58-60.
[9] Giordani A，Kobel W，Gally HU. Overall impact of the regulatory requirements for genotoxic impurities on the drug development process[J].Eur J Pharm Sci，2011，43（1-2）：1-15.
[10] Raman NVVSS，Prasad AVSS，Reddy KR. Strategies for the identification， control and determination ofgenotoxic impurities in drug substance：A pharmaceutical industryperspective [J].J Pharm Biomed Anal，2011，55（4）：662-667.
[11] 张园园，李银峰，王杰晶，等.药物中痕量磺酸酯类物质的检测技术研究进展[J].药物评价研究，2012，35（4）：304-306.
[12] Kakadiya PR，Reddy BP，Singh V，et al.Low level determinations of methyl methanesulfonate and ethyl methanesulfonate impurities in Lopinavir and Ritonavir active pharmaceutical ingredients by LC/MS/MS using electrospray ionization[J].J Pharm Biomed Anal，2011，55（2）：379-384.
[13] Montesano MA，Whitehead JRD，Jayatilaka NK，et al. Measurement of methyl methanesulfonate in humaan plasma and breast milk samples using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-tandem mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2010，52（2）：260-264.
[14] An V，Sun M，Bai L，et al. A practical derivatization LC/MS approach for determination of trace level alkyl sulfonates and dialkyl sulfates genotoxic impurities in drug substances [J].J Pharm Biomed Anal， 2008，48（3）：1006-1010.
[15] Oostendorp RL，Beijnen JH，Schellensi HM，et al. Determination of imatinib mesylate and its main metabolite （cgp74588） in human plasma and murine specimens by ion-pairing reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].Biomed Chromatogr Published Online，2007，27（3）：34-36.
（收稿日期：2013-07-12）