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摘要：目的： 建立祛瘀降脂片中芍药苷的含量测定方法。方法： 采用HPLC法，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱，流动相为甲醇_0.1%磷酸溶液（14：86），流速为1.0ml/min；检测波长为230nm；柱温为30℃。结果：采用高效液相色谱法测定芍药苷的含量，线性关系良好，线性范围为0.1634ug—1.634ug， 平均加样回收率为98.48%，RSD%为1.39% 。结论：所建立的方法简便易行、准确可靠，可用于祛瘀降脂片的质量控制。
关键词：祛瘀降脂片；芍药苷；HPLC；含量测定
中图分类号：R972+.6 文献标识码：C 文章编号：1005-0515（2013）9-010-02
祛瘀降脂片系我院自制剂，由大黄、白芍、桃仁、地黄、山楂、泽泻、白术等11味中药组成。具有活血化瘀、祛除痰浊、疏通脉络的功效，主要用于高血脂症、脑血栓后遗症、动脉粥样硬化。白芍为方中要药，功能养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳。现代药理研究发现白芍中的主要成分芍药苷能扩张血管、保护脑缺血、抗血小板聚集、抗血栓形成，有提高抗高脂肪高胆固醇引起的促血栓形成的作用。原标准无含量控制项，笔者采用HPLC法对方中白芍的主要成分芍药苷进行了含量测定[1-4]，为其质量控制提供依据。现报告如下。
1仪器、试药与材料
Waters 510型高效液相色谱仪（美国）、Waters 486紫外检测器、威玛通用多媒体色谱数据工作站；SB3200超声清洗机（上海必能信超声有限公司）、AEL_200电子天平（日本岛津）。芍药苷对照品（批号：110736—201136）购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），水为重蒸馏水（自制），其他试剂均为分析纯。祛瘀降脂片由本院制剂室提供（批号：20120911、20121105、20121222、20130201、20130417）。
2方法与结果
2.1色谱条件 色谱柱： DiamonsilC18（4.6mm×250mm，5um）；流动相：甲醇_0.1%磷酸溶液（14：86）；流速为1.0ml/min；检测波长：230nm；柱温：30℃。
2.2 溶液制备
2.2.1对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含60ug的溶液，即得。
2.2.2供试品溶液的制备方法 取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，取2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（300W，40KHz）30min， 放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性对照品溶液的制备 按照祛瘀降脂片的制备工艺制备缺白芍的阴性样品，按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。
2.3 系统适用性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样10ul，记录色谱图。结果表明，供试品溶液在对照品溶液色谱峰相应位置上有相应峰，而阴性对照品溶液色谱中无此峰，说明阴性无干扰。在此条件下，芍药苷峰与样品中其它组分色谱峰可达基线分离，分离度大于1.5；理论板数按芍药苷峰计算，应不低于3000。（见图1）
A-对照品
B-供试品
C-阴性对照品
图1 祛瘀降脂片HPLC图 （1_芍药苷）
2.4 线性关系考察 精密称取芍药苷对照品16.34mg，置50ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。精密量取0.5、1.0、2.0、3.0、5.0ml，分别置10ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，按上述色谱条件分别进样10ul测定。以进样量（ug）为横坐标（X），峰面积积峰值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程为：Y=46948140.35X+52424.3789，r=0.9992（n=5），结果表明：进样量在0.1634ug—1.634ug范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液10uL，重复进样6次，测定芍药苷峰面积。结果表明，机器精密度良好。RSD%为1.06%（n=6）
2.6 稳定性试验 对同一供试品溶液（批号：20121222），于0、2、4、8、16、24h依法测定，记录芍药苷峰面积，试验结果表明，在24h内被测物稳定。RSD%为1.21%（n=6）。
2.7 重复性试验 对同一批样品（批号：20121222），平行测定6份，计算芍药苷含量。结果平均含量为1.120mg/g，RSD%为1.70%（n=6），结果表明，重复性良好。
2.8 加样回收率试验 取已知含量为1.120mg/g（批号20121222）的样品约0.5g，共5份，精密称定，分别精密加入浓度为0.3268mg·mL-1芍药苷对照品贮备液1ml，按2.2.2项下方法制备5份加样回收样品溶液，测定，计算回收率。结果显示平均加样回收率为98.48%，RSD%为1.39%（n=5）。
2.9 样品含量测定 取5批样品，按上述含量测定方法，测定芍药苷含量，结果显示平均含量为1.124mg/g。考虑到药材来源及生产的实际情况，笔者暂定本品含白芍以芍药苷计不得少于1.10mg/g。
3 讨论
芍药苷是白芍重要有效成分之一，具有较强的生理活性。故以芍药苷的含量作为质量控制指标。
本文参照《中国药典》和相关文献报道[1-4]，在紫外_可见分光光度计上芍药苷对照品溶液在230nm处有最大吸收，故选择230nm作为检测波长。
用50%甲醇为提取溶剂[5]，分别采用超声10，20，30，40，60min进行提取，结果表明超声20min可以提取完全，为确保提取完全，选择30min为样品提取时间。
流动相的选择，因乙腈有毒且价格相对较贵，可由呼吸或经皮肤进入人体，损害研究人员的健康，故流动相选择相对危险性小的甲醇而弃用乙腈。选择甲醇一0.1 % 磷酸（ 14：86）作为本方法的流动相，其效果较好，色谱峰不拖尾，可达到基线分离，分离度符合要求。
从5批样品的含量测定结果可知，其芍药苷测得值相差较大，这可能与所采用药材的产地、采收季节以及白芍根的直径等不同有直接关系。
采用高效液相色谱法测定祛瘀降脂片中芍药苷含量，方法简单易行，具有准确、灵敏、重现性好等优点，可以用于祛瘀降脂片的质量控制。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010.95-96
[2] 李文博，韩建平，倪倩等.SPE—UPLC法测定养血清脑颗粒中的芍药苷含量[J].药物分析杂志 ，2011，31（7）：1385.
[3]林月英，董宪凤.HPLC法测定三九胃泰颗粒中芍药苷的含量[J].天津药学，2012，24（4）：12—13.
[4]奚永兰，徐富柱.高效液相色谱法测定乳宁颗粒中芍药苷的含量[J].中国民族民间医药，2012， 21（6）：42—43.
[5]张庆、马骏、辛俐华.高效液相色谱法测定鳖甲煎丸中芍药苷和黄芩苷的含量[J].医药导报，2013，32（3）：356—359
关键词：祛瘀降脂片；芍药苷；HPLC；含量测定
中图分类号：R972+.6 文献标识码：C 文章编号：1005-0515（2013）9-010-02
祛瘀降脂片系我院自制剂，由大黄、白芍、桃仁、地黄、山楂、泽泻、白术等11味中药组成。具有活血化瘀、祛除痰浊、疏通脉络的功效，主要用于高血脂症、脑血栓后遗症、动脉粥样硬化。白芍为方中要药，功能养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳。现代药理研究发现白芍中的主要成分芍药苷能扩张血管、保护脑缺血、抗血小板聚集、抗血栓形成，有提高抗高脂肪高胆固醇引起的促血栓形成的作用。原标准无含量控制项，笔者采用HPLC法对方中白芍的主要成分芍药苷进行了含量测定[1-4]，为其质量控制提供依据。现报告如下。
1仪器、试药与材料
Waters 510型高效液相色谱仪（美国）、Waters 486紫外检测器、威玛通用多媒体色谱数据工作站；SB3200超声清洗机（上海必能信超声有限公司）、AEL_200电子天平（日本岛津）。芍药苷对照品（批号：110736—201136）购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），水为重蒸馏水（自制），其他试剂均为分析纯。祛瘀降脂片由本院制剂室提供（批号：20120911、20121105、20121222、20130201、20130417）。
2方法与结果
2.1色谱条件 色谱柱： DiamonsilC18（4.6mm×250mm，5um）；流动相：甲醇_0.1%磷酸溶液（14：86）；流速为1.0ml/min；检测波长：230nm；柱温：30℃。
2.2 溶液制备
2.2.1对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含60ug的溶液，即得。
2.2.2供试品溶液的制备方法 取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，取2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（300W，40KHz）30min， 放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性对照品溶液的制备 按照祛瘀降脂片的制备工艺制备缺白芍的阴性样品，按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。
2.3 系统适用性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样10ul，记录色谱图。结果表明，供试品溶液在对照品溶液色谱峰相应位置上有相应峰，而阴性对照品溶液色谱中无此峰，说明阴性无干扰。在此条件下，芍药苷峰与样品中其它组分色谱峰可达基线分离，分离度大于1.5；理论板数按芍药苷峰计算，应不低于3000。（见图1）
A-对照品
B-供试品
C-阴性对照品
图1 祛瘀降脂片HPLC图 （1_芍药苷）
2.4 线性关系考察 精密称取芍药苷对照品16.34mg，置50ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。精密量取0.5、1.0、2.0、3.0、5.0ml，分别置10ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，按上述色谱条件分别进样10ul测定。以进样量（ug）为横坐标（X），峰面积积峰值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程为：Y=46948140.35X+52424.3789，r=0.9992（n=5），结果表明：进样量在0.1634ug—1.634ug范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液10uL，重复进样6次，测定芍药苷峰面积。结果表明，机器精密度良好。RSD%为1.06%（n=6）
2.6 稳定性试验 对同一供试品溶液（批号：20121222），于0、2、4、8、16、24h依法测定，记录芍药苷峰面积，试验结果表明，在24h内被测物稳定。RSD%为1.21%（n=6）。
2.7 重复性试验 对同一批样品（批号：20121222），平行测定6份，计算芍药苷含量。结果平均含量为1.120mg/g，RSD%为1.70%（n=6），结果表明，重复性良好。
2.8 加样回收率试验 取已知含量为1.120mg/g（批号20121222）的样品约0.5g，共5份，精密称定，分别精密加入浓度为0.3268mg·mL-1芍药苷对照品贮备液1ml，按2.2.2项下方法制备5份加样回收样品溶液，测定，计算回收率。结果显示平均加样回收率为98.48%，RSD%为1.39%（n=5）。
2.9 样品含量测定 取5批样品，按上述含量测定方法，测定芍药苷含量，结果显示平均含量为1.124mg/g。考虑到药材来源及生产的实际情况，笔者暂定本品含白芍以芍药苷计不得少于1.10mg/g。
3 讨论
芍药苷是白芍重要有效成分之一，具有较强的生理活性。故以芍药苷的含量作为质量控制指标。
本文参照《中国药典》和相关文献报道[1-4]，在紫外_可见分光光度计上芍药苷对照品溶液在230nm处有最大吸收，故选择230nm作为检测波长。
用50%甲醇为提取溶剂[5]，分别采用超声10，20，30，40，60min进行提取，结果表明超声20min可以提取完全，为确保提取完全，选择30min为样品提取时间。
流动相的选择，因乙腈有毒且价格相对较贵，可由呼吸或经皮肤进入人体，损害研究人员的健康，故流动相选择相对危险性小的甲醇而弃用乙腈。选择甲醇一0.1 % 磷酸（ 14：86）作为本方法的流动相，其效果较好，色谱峰不拖尾，可达到基线分离，分离度符合要求。
从5批样品的含量测定结果可知，其芍药苷测得值相差较大，这可能与所采用药材的产地、采收季节以及白芍根的直径等不同有直接关系。
采用高效液相色谱法测定祛瘀降脂片中芍药苷含量，方法简单易行，具有准确、灵敏、重现性好等优点，可以用于祛瘀降脂片的质量控制。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010.95-96
[2] 李文博，韩建平，倪倩等.SPE—UPLC法测定养血清脑颗粒中的芍药苷含量[J].药物分析杂志 ，2011，31（7）：1385.
[3]林月英，董宪凤.HPLC法测定三九胃泰颗粒中芍药苷的含量[J].天津药学，2012，24（4）：12—13.
[4]奚永兰，徐富柱.高效液相色谱法测定乳宁颗粒中芍药苷的含量[J].中国民族民间医药，2012， 21（6）：42—43.
[5]张庆、马骏、辛俐华.高效液相色谱法测定鳖甲煎丸中芍药苷和黄芩苷的含量[J].医药导报，2013，32（3）：356—359