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摘要：目的：观察Ras蛋白在继发性中耳胆脂瘤组织中的表达活性及其病理意义。方法：32例胆脂瘤上皮标本和12例正常面部表皮标本，免疫组织化学法（SP法）分别检测Ras蛋白表达水平，并应用HPIAL-2000高分辨图象分析系统进行半定量分析，比较不同组织中的Ras活性表达差异。结果：Ras蛋白的免疫阳性染色物呈棕黄色颗粒。在胆脂瘤上皮细胞，阳性反应物位于胞膜者28例（28/32）；同时位于胞膜、胞浆者2例（2/32）；仅存在于胞浆者2例（2/32）。在正常表皮细胞，阳性反应物主要位于胞膜，以基底层细胞着色为主。两组的阳性反应物平均吸光度（A值）分别为0.826和0.438，组间差异具有统计学意义（P＜0.001）。结论：继发性中耳胆脂瘤上皮组织中Ras蛋白的表达活性明显升高，提示胆脂瘤上皮具有高度的增殖活性。
关键词：中耳胆脂瘤Ras蛋白免疫组织化学表达活性病理意义
Doi:10.3969/j.issn.1671-8801.2014.08.011【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801(2014)08-0012-01
胆脂瘤的确切病因和发病机理至今未明，有关胆脂瘤的研究已进入分子生物学等领域，人们发现许多生长因子和细胞因子，在胆脂瘤中存在明显表达，如白细胞介素l（IL－1）、肿瘤坏死因子a（TNF－a）、血小板生长因子（PDGF）等，认为它们在细胞的生长、繁殖、分化等过程中有重要作用，与胆脂瘤的发生发展关系密切。而有着类似“分子开关”作用的Ras蛋白在这些生长因子和细胞因子作用的细胞传递通路中发挥着关键性的调控作用。为探讨Ras蛋白在中耳继发性胆脂瘤上皮中的表达，分析其与胆脂瘤上皮细胞增生调节的可能作用，我们采用免疫组织化学SP技术和HPIAL－2000高分辨图象系统研究了Ras蛋白在继发性中耳胆脂瘤中的表达。报道如下。
1材料与方法
1.1材料。所有组织标本均取自2011年3月－2013年5月我科住院手术患者。32例胆脂瘤型中耳炎患者，男19例，女13例；年龄22－48岁。所有标本均经病理诊断确诊。从每例中取出一块胆脂瘤组织。12例面部皮肤分别从面部外伤和面部美容手术中取得，其中男5例，女7例；年龄18-32岁；作为正常表皮组织以示对照。以上标本离体后放入4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，4um厚切片。
1.2试剂及来源。鼠抗人ras－P21单克隆抗体（武汉博士德公司），普通小鼠zgG抗体（美国Santa Cruz BioteCh公司），SP试剂盒（福州迈新公司）。
1.3方法。石蜡切片，厚4林m，常规脱腊至水洗；3％过氧化氢孵育smin，消除内源性过氧化物酶活性；蒸馏水冲洗，磷酸缓冲液（phosPhatebuf兔redsolution，PBS）浸泡smin，微波炉抗原修复；5％正常山羊血清室温孵育10min，倾去血清，加入1：50Ras单抗，37℃孵育30min，用普通小鼠IgG代替Ras单抗做对照，PBS冲洗，smin，3次；滴加生物素标记的二抗37℃孵育30min，PBS冲洗，3min，3次；加链霉素抗生物素一过氧化物酶37℃孵育30min，PBS冲洗，3min，3次；二氨基联苯胺（DAB）显色，自来水冲洗，苏木素复染色，中性树胶封片。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知的阳性片作阳性对照。
1.4结果判断和统计学分析。免疫组织化学结果阳性细胞中有棕黄色的阳性反应产物。随机选取5个视野（x400），采用HPIAL－2000型高分辨图象分析仪（同济千屏影像工程公司提供）测量上皮阳性细胞的吸收度（A值），取其平均值进行统计学处理。用SPSS11.5对两组数据进行t检验。
2结果
2.1免疫组织化学染色结果。Ras蛋白阳性染色为棕黄色颗粒状物。12例正常表皮细胞主要是胞膜着色，颗粒稀疏，染色淡；胆脂瘤上皮细胞各层均有阳性反应，颗粒粗，着色深，胞膜着色28例，胞膜和胞浆着色2例，仅有胞浆着色2例。
2.2统计学分析。正常表皮组织中的Ras蛋白的吸收值（A值）为0.438±0.089，胆脂瘤上皮组织中的A值为0.826±0.064，两者差异有统计学意义（t＝6.852，P<0.001）。
3讨论
细胞癌基因的Ras家族所编码的蛋白质都是P21，位于细胞质膜内侧面，P21可与GTP相结合，具有GTP酶活性，并参与cAMP水平调节。Ras蛋白是由一条多肤链组成的单体蛋白，又名P21蛋白和小G蛋白，由原癌基因Ras编码，是细胞生长分化信号传递通路上的分子开关蛋白，在Ras信号系统中以Ras蛋白为中心，调节细胞的生长和分化。
Huang等（1996年）认为胆脂瘤组织上皮各层均有Ras蛋白的明显表达，且在基底层着色较深，而在正常表皮组织未见明显染色。本文研究结果中，胆脂瘤上皮细胞各层均有阳性反应，其中胞膜着色28例（28/32），胞膜和胞浆着色2例（2/32），仅有胞浆着色2例（2/32），正常表皮细胞主要是胞膜着色，染色淡，结果与Huang等基本一致。
有研究表明，Ras基因的异常可作为人体某些肿瘤的预后指标，很多肿瘤组织中均发现有Ras蛋白的过度表达。基因突变、基因扩增或转录增強等多种因素均可激活Ras基因，使得Ras蛋白大量表达；胆脂瘤非真性肿瘤，其临床特征表现为中耳腔内存在高度增殖的角化鳞状上皮和邻近的骨质破坏，Ras蛋白的增加推论不是由于Ras基因突变所致。在炎症等因素的刺激下，多种生长因子和细胞因子在胆脂瘤组织中表达增高，胆脂瘤中的Ras蛋白的表达也可能与这些生长因子和细胞因子关系密切。
Ras蛋白共价结合于胞浆膜内侧面，且只有定位于胞浆膜内侧面上的Ras蛋白才具有生物活性。我们在染色结果中观察到胆脂瘤上皮细胞多为胞膜着色28例（28/32），胞膜、胞浆着色4例（4/32），表明Ras蛋白的合成增加，胆脂瘤上皮细胞增生活跃。
尽管胆脂瘤的发病机理仍未阐明，但人们已经发现了多种生长因子和细胞因子在胆脂瘤中的高表达，而在这些因子引起细胞增殖的信息通路上的调控蛋白-Ras蛋白在胆脂瘤组织中存在高表达。用细胞生长信号传导阻滞剂已成功用于治疗肿瘤及其它疾病，从而启示我们以Ras蛋白阻滞剂在胆脂瘤的药物治疗上的新前景。
关键词：中耳胆脂瘤Ras蛋白免疫组织化学表达活性病理意义
Doi:10.3969/j.issn.1671-8801.2014.08.011【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801(2014)08-0012-01
胆脂瘤的确切病因和发病机理至今未明，有关胆脂瘤的研究已进入分子生物学等领域，人们发现许多生长因子和细胞因子，在胆脂瘤中存在明显表达，如白细胞介素l（IL－1）、肿瘤坏死因子a（TNF－a）、血小板生长因子（PDGF）等，认为它们在细胞的生长、繁殖、分化等过程中有重要作用，与胆脂瘤的发生发展关系密切。而有着类似“分子开关”作用的Ras蛋白在这些生长因子和细胞因子作用的细胞传递通路中发挥着关键性的调控作用。为探讨Ras蛋白在中耳继发性胆脂瘤上皮中的表达，分析其与胆脂瘤上皮细胞增生调节的可能作用，我们采用免疫组织化学SP技术和HPIAL－2000高分辨图象系统研究了Ras蛋白在继发性中耳胆脂瘤中的表达。报道如下。
1材料与方法
1.1材料。所有组织标本均取自2011年3月－2013年5月我科住院手术患者。32例胆脂瘤型中耳炎患者，男19例，女13例；年龄22－48岁。所有标本均经病理诊断确诊。从每例中取出一块胆脂瘤组织。12例面部皮肤分别从面部外伤和面部美容手术中取得，其中男5例，女7例；年龄18-32岁；作为正常表皮组织以示对照。以上标本离体后放入4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，4um厚切片。
1.2试剂及来源。鼠抗人ras－P21单克隆抗体（武汉博士德公司），普通小鼠zgG抗体（美国Santa Cruz BioteCh公司），SP试剂盒（福州迈新公司）。
1.3方法。石蜡切片，厚4林m，常规脱腊至水洗；3％过氧化氢孵育smin，消除内源性过氧化物酶活性；蒸馏水冲洗，磷酸缓冲液（phosPhatebuf兔redsolution，PBS）浸泡smin，微波炉抗原修复；5％正常山羊血清室温孵育10min，倾去血清，加入1：50Ras单抗，37℃孵育30min，用普通小鼠IgG代替Ras单抗做对照，PBS冲洗，smin，3次；滴加生物素标记的二抗37℃孵育30min，PBS冲洗，3min，3次；加链霉素抗生物素一过氧化物酶37℃孵育30min，PBS冲洗，3min，3次；二氨基联苯胺（DAB）显色，自来水冲洗，苏木素复染色，中性树胶封片。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知的阳性片作阳性对照。
1.4结果判断和统计学分析。免疫组织化学结果阳性细胞中有棕黄色的阳性反应产物。随机选取5个视野（x400），采用HPIAL－2000型高分辨图象分析仪（同济千屏影像工程公司提供）测量上皮阳性细胞的吸收度（A值），取其平均值进行统计学处理。用SPSS11.5对两组数据进行t检验。
2结果
2.1免疫组织化学染色结果。Ras蛋白阳性染色为棕黄色颗粒状物。12例正常表皮细胞主要是胞膜着色，颗粒稀疏，染色淡；胆脂瘤上皮细胞各层均有阳性反应，颗粒粗，着色深，胞膜着色28例，胞膜和胞浆着色2例，仅有胞浆着色2例。
2.2统计学分析。正常表皮组织中的Ras蛋白的吸收值（A值）为0.438±0.089，胆脂瘤上皮组织中的A值为0.826±0.064，两者差异有统计学意义（t＝6.852，P<0.001）。
3讨论
细胞癌基因的Ras家族所编码的蛋白质都是P21，位于细胞质膜内侧面，P21可与GTP相结合，具有GTP酶活性，并参与cAMP水平调节。Ras蛋白是由一条多肤链组成的单体蛋白，又名P21蛋白和小G蛋白，由原癌基因Ras编码，是细胞生长分化信号传递通路上的分子开关蛋白，在Ras信号系统中以Ras蛋白为中心，调节细胞的生长和分化。
Huang等（1996年）认为胆脂瘤组织上皮各层均有Ras蛋白的明显表达，且在基底层着色较深，而在正常表皮组织未见明显染色。本文研究结果中，胆脂瘤上皮细胞各层均有阳性反应，其中胞膜着色28例（28/32），胞膜和胞浆着色2例（2/32），仅有胞浆着色2例（2/32），正常表皮细胞主要是胞膜着色，染色淡，结果与Huang等基本一致。
有研究表明，Ras基因的异常可作为人体某些肿瘤的预后指标，很多肿瘤组织中均发现有Ras蛋白的过度表达。基因突变、基因扩增或转录增強等多种因素均可激活Ras基因，使得Ras蛋白大量表达；胆脂瘤非真性肿瘤，其临床特征表现为中耳腔内存在高度增殖的角化鳞状上皮和邻近的骨质破坏，Ras蛋白的增加推论不是由于Ras基因突变所致。在炎症等因素的刺激下，多种生长因子和细胞因子在胆脂瘤组织中表达增高，胆脂瘤中的Ras蛋白的表达也可能与这些生长因子和细胞因子关系密切。
Ras蛋白共价结合于胞浆膜内侧面，且只有定位于胞浆膜内侧面上的Ras蛋白才具有生物活性。我们在染色结果中观察到胆脂瘤上皮细胞多为胞膜着色28例（28/32），胞膜、胞浆着色4例（4/32），表明Ras蛋白的合成增加，胆脂瘤上皮细胞增生活跃。
尽管胆脂瘤的发病机理仍未阐明，但人们已经发现了多种生长因子和细胞因子在胆脂瘤中的高表达，而在这些因子引起细胞增殖的信息通路上的调控蛋白-Ras蛋白在胆脂瘤组织中存在高表达。用细胞生长信号传导阻滞剂已成功用于治疗肿瘤及其它疾病，从而启示我们以Ras蛋白阻滞剂在胆脂瘤的药物治疗上的新前景。