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摘要：目的 观察解毒清肺合剂对慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰热蕴肺证模型大鼠气道黏液高分泌的影响。方法 96只大鼠随机分为对照组、模型组、中药治疗组，模型组和中药治疗组采用香烟烟雾暴露与脂多糖气道内滴入联合造模方法制备模型大鼠。实验第1日起，中药治疗组以解毒清肺合剂按1 mL/100 g剂量灌胃，每日1次；模型组以生理盐水按1 mL/100 g剂量灌胃，每日1次；空白对照组正常喂养。于实验第10、20、30、40日分期取材，取肺组织行阿尔辛蓝-过碘雪夫染色，计算气道杯状细胞数目。结果 与对照组比较，模型组各期杯状细胞数目均明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，中药治疗组第20、30、40日时杯状细胞数目明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 解毒清肺合剂可以减少慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰热蕴肺证模型大鼠气道杯状细胞的化生，减少气道黏液高分泌。
关键词：慢性阻塞性肺疾病急性加重期；气道黏液高分泌；杯状细胞；痰热蕴肺证；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）08-0031-03
目前，慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病机制仍然不清，临床依旧缺乏有效的治疗手段。与气道杯状细胞密切相关的气道黏液高分泌是COPD的重要病理生理特征，黏液分泌增多可以堵塞气道，为病原体定植提供有利条件，这成为COPD病情加重及反复的主要原因[1]。气道黏液高分泌已经成为影响COPD病情及预后的独立危险因素，针对气道黏液高分泌的治疗可能会对COPD的整体治疗产生重大影响。
COPD属于中医“肺胀”范畴，痰热藴肺证是慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）的主要证候之一[2]，临床研究表明清热化痰法可以显著改善患者临床症状，我们的研究也显示清热化痰理气法中药复方可以减少AECOPD患者的痰液分泌，减少黏蛋白（MUC）5AC的表达[3-4]。为了进一步研究其作用机理，我们使用解毒清肺合剂为治疗药物，以清肺热、解热毒为基本立法，从病机出发干预AECOPD大鼠气道黏液高分泌，现报道如下。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性Wistar大鼠96只，鼠龄2个月，体质量（250±20）g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2009-0007。
1.2 药物与试剂
解毒清肺合剂（北京中医药大学东直门医院院内制剂，批号11040101），脂多糖（LPS，Sigma L2880），阿尔辛蓝溶液、冰乙酸溶液、过碘酸溶液、Schiff溶液（均购于北京益利精细化学品有限公司），大前门牌香烟。
1.3 主要仪器
切片机（Leitz 1516），显微镜（OLYMPUS BX60），Image-Pro Plus 6.0图像分析软件。
2 实验方法
2.1 造模
使用香烟烟雾暴露联合LPS气道内滴入法建立模型。以往研究显示，第20日时模型大鼠肺功能及病理改变符合COPD病理改变，其外在症状与AECOPD痰热蕴肺证表现相似[5]。香烟烟雾连续暴露28 d，每日上午1次，每次30 min；LPS分别于第1、11、21日气道内滴入，滴药日不烟熏。选择16号静脉套管针作为气道内给药的插管针，将钢制针芯用细沙轮磨去针尖，与塑料外套管平齐，并将钢芯前端与外壁打磨光滑，用棉花擦拭，以不拉棉丝为度；采用烟熏箱烟熏大鼠，每次点燃大前门香烟8支，每个箱中一次烟熏10只大鼠。LPS用0.9%氯化钠溶液配制为1 mg/mL溶液，将麻醉后大鼠仰卧，四肢、口齿固定于鼠板，以台灯照射其胸部，术者左手持棉纱，右手用套管针将大鼠舌头顶出，左手持棉纱包裹舌头后向上向外拉起，暴露气管开口，将套针插入气管，拔出针芯，以棉丝确定塑料套管位于气管内，抽取配制好的LPS溶液200 ?L，注入气道，拔出套管针，将大鼠直立左右摇摆，使LPS溶液均匀分布于两肺，取下大鼠。
2.2 分组及给药
大鼠随机分为对照组、模型组、治疗组，每组32只。造模第1日起治疗组给予解毒清肺合剂（按1∶1用0.9%氯化钠溶液稀释，1 mL/100 g，每日1次灌胃），模型组灌胃0.9%氯化钠溶液（1 mL/100 g，每日1次灌胃），对照组正常喂养。
2.3 标本采集
实验第10、20、30、40日分期处死各组大鼠，每期24只，每组各8只。麻醉大鼠，仰卧固定于鼠板，开胸暴露肺脏，摘除肺脏，置于4 ℃生理盐水中漂洗2次，取左肺以4%多聚甲醛灌注，放入20倍多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。
2.4 阿尔辛蓝-过碘雪夫染色
连续切片，厚度5 ?m，常规脱蜡至水，蒸馏水洗3次，3%乙酸溶液3 min，1%阿尔辛蓝溶液染色20 min，过碘酸氧化液20 min，自来水充分洗，蒸馏水洗，Schiff液染色20 min，流水冲洗5 min，经95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。各组选取3张切片，每张切片随机选取5个视野，使用Image-Pro Plus 6.0软件计数每个视野下杯状细胞总数。
3 统计学方法
采用SPSS17.0软件进行数据处理。数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，并进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
与对照组相比，模型组、治疗组大鼠从造模第3日开始烟熏时口鼻部黏液分泌明显增多，躁动不安，呼吸急促，收腹、抬头明显。第15日开始模型组以上症状加重，大鼠皮毛光泽减退，体质量减轻。
4.2 病理观察
对照组大鼠气道上皮中蓝色阳性细胞较少，模型组第20日时明显增多，治疗组阳性细胞较对照组增多，随治疗时间延长逐渐减少，至恢复正常。阿尔辛蓝-过碘雪夫（AB-PAS）染色结果见图1。 5 讨论
过多的气道黏液堵塞气道，已成为COPD发病率、死亡率增高的主要原因，而针对气道黏液高分泌的治疗在COPD整体治疗中的作用越来越受到重视。黏液由MUC、水、脂类、糖类、电解质等组成，MUC是其最重要的组成部分。迄今共发现20种MUC基因，其中MUC5AC、MUC5B、MUC2与慢性气道炎症所致的气道黏液高分泌密切相关。AECOPD气道黏液高分泌主要由MUC5AC分泌增多引起，MUC5AC由气道上皮的杯状细胞分泌[6]。因此，可以用杯状细胞的数目变化来反映MUC5AC量的变化，以此衡量药物对AECOPD气道黏液高分泌的影响。
COPD属中医学“肺胀”范畴，本虚标实是其病机主要特点。感邪时以标实为主，有风寒、风热、痰浊、痰热之别；平时以虚为主，当分清肺、脾、肾、心不同脏腑，阴虚、阳虚不同性质。急性期多因外感淫邪、情志不畅或饮食失宜，邪热郁肺，炼液为痰，痰热互结所导致，痰热蕴肺证是其主要的证候。本证候以标实为主，治疗当以清肺化痰、降逆平喘为法。以往中医药研究AECOPD气道黏液高分泌多以单味化痰中药的作用研究为主[7-8]，处方多从清金化痰汤、麻杏石甘汤、越婢加半夏汤、桑白皮汤加减，临床治疗取得显著疗效，并证明可以改善气道黏液高分泌[9]。我们认为痰热藴肺证以热邪、痰邪为患，究其本质，热邪为因、痰邪为果，热邪为本，痰浊为标，因此从其病机出发，通过清肺热、解热毒，以此截断热邪、痰浊间的内在关联，则可热去津化，痰消喘平，减轻气道黏液高分泌。解毒清肺合剂是北京中医药大学东直门医院治疗风温肺热病痰热壅肺证的有效院内制剂[10]，全方以清热解毒、宣肺止咳为基本立法，是在麻杏石甘汤基础上加入桔梗、黄芩、牛蒡子、僵蚕、白花蛇舌草等组成。前期研究结果表明，解毒清肺合剂可以提高巨噬细胞吞噬功能，阻止病毒感染，促进感染恢复[11]，并能提高流感病毒A/PR/8/34（H1N1）感染小白鼠血凝素抗体及神经氨酸酶抗体水平[12]，对于病毒性肺炎、流感等多种温热毒邪所致的肺系感染性疾病有良好的解热止咳、化痰平喘作用。因此我们在此基础上设计了本次实验，以观察解毒清肺合剂对气道黏液高分泌的影响及其作用机理。实验结果表明，使用解毒清肺合剂治疗，可以达到改善气道黏液高分泌的目的，其作用机理与减少模型大鼠气道杯状细胞的化生有关。
本实验从病因病机层面干预气道黏液高分泌，证明了中医辨证论治对于COPD黏液高分泌治疗的有效性和思路的多样性，也说明前期实验使用清热理气化痰中药复方减少黏液高分泌的作用机理绝不仅仅在于化痰药物的使用，其具体作用机理值得进一步研究。
参考文献：
[1] Vestbo J， Prescott E， Lange P. Association of chronic mucus hypersecretion with FEV1 decline and chronic obstructive pulmonary disease morbidity：Copenhagen City Heart Study Group[J]. Am J Respir Crit Care Med，1996，153：1530-1535.
[2] 王至婉，李建生，余学庆，等.慢性阻塞性肺疾病急性加重期证候及特征的临床调查研究[J].中华中医药杂志，2010，25（4）：504-509.
[3] 冯淬灵，于会勇，黄文通，等.清热化痰理气中药复方治疗65例急性加重期慢性阻塞性肺疾病疗效评价[J].北京中医药大学学报，2011，34（11）：786-790.
[4] 冯淬灵，张立山.清热化痰法抗慢性阻塞性肺疾病气道黏液高分泌浅析[J].北京中医药大学学报，2007，30（增刊）：125-126.
[5] 武红莉，冯淬灵.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型病理形态学比较研究[J].心肺血管病杂志，2006，25（4）：233-235.
[6] 周向东，童瑾，兰箭.慢性阻塞性肺疾病患者气道粘蛋白分子表型的研究[J].中华呼吸和结核杂志，2002，25（7）：437.
[7] 童瑾，周向东.代表性祛痰中药提取物对气道粘膜上皮细胞粘蛋白的影响[J].中药药理与临床，2006，22（2）：33-34.
[8] 邓青南，周建龙，郭振辉，等.半夏提取物对气道黏液高分泌的影响[J].中国呼吸与危重监护杂志，2009，8（5）：477-481.
[9] 李文，毛兵，王刚，等.从气道炎症和气道黏液高分泌研究清热化痰法治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰热阻肺证的机制[J].中西医结合学报，2008，6（8）：799-805.
[10] 王成祥，杜怀棠.辨证治疗老年风温肺热病55例[J].中国中医急症， 1992，1（1）：33-36.
[11] 王成祥，王惠芳，姜良铎，等.清肺饮对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响[J].中国中医药信息杂志，2003，10（10）：32-33.
[12] 王成祥，王惠芳，沈杏生，等.清肺饮对流感病毒A/PR/8/34（H1N1）感染小白鼠血凝素抗体、神经氨酸酶抗体的影响[J].中国中药杂志，2004，
29（2）：100-101.
（收稿日期：2012-04-02，编辑：华强）
关键词：慢性阻塞性肺疾病急性加重期；气道黏液高分泌；杯状细胞；痰热蕴肺证；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）08-0031-03
目前，慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病机制仍然不清，临床依旧缺乏有效的治疗手段。与气道杯状细胞密切相关的气道黏液高分泌是COPD的重要病理生理特征，黏液分泌增多可以堵塞气道，为病原体定植提供有利条件，这成为COPD病情加重及反复的主要原因[1]。气道黏液高分泌已经成为影响COPD病情及预后的独立危险因素，针对气道黏液高分泌的治疗可能会对COPD的整体治疗产生重大影响。
COPD属于中医“肺胀”范畴，痰热藴肺证是慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）的主要证候之一[2]，临床研究表明清热化痰法可以显著改善患者临床症状，我们的研究也显示清热化痰理气法中药复方可以减少AECOPD患者的痰液分泌，减少黏蛋白（MUC）5AC的表达[3-4]。为了进一步研究其作用机理，我们使用解毒清肺合剂为治疗药物，以清肺热、解热毒为基本立法，从病机出发干预AECOPD大鼠气道黏液高分泌，现报道如下。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性Wistar大鼠96只，鼠龄2个月，体质量（250±20）g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2009-0007。
1.2 药物与试剂
解毒清肺合剂（北京中医药大学东直门医院院内制剂，批号11040101），脂多糖（LPS，Sigma L2880），阿尔辛蓝溶液、冰乙酸溶液、过碘酸溶液、Schiff溶液（均购于北京益利精细化学品有限公司），大前门牌香烟。
1.3 主要仪器
切片机（Leitz 1516），显微镜（OLYMPUS BX60），Image-Pro Plus 6.0图像分析软件。
2 实验方法
2.1 造模
使用香烟烟雾暴露联合LPS气道内滴入法建立模型。以往研究显示，第20日时模型大鼠肺功能及病理改变符合COPD病理改变，其外在症状与AECOPD痰热蕴肺证表现相似[5]。香烟烟雾连续暴露28 d，每日上午1次，每次30 min；LPS分别于第1、11、21日气道内滴入，滴药日不烟熏。选择16号静脉套管针作为气道内给药的插管针，将钢制针芯用细沙轮磨去针尖，与塑料外套管平齐，并将钢芯前端与外壁打磨光滑，用棉花擦拭，以不拉棉丝为度；采用烟熏箱烟熏大鼠，每次点燃大前门香烟8支，每个箱中一次烟熏10只大鼠。LPS用0.9%氯化钠溶液配制为1 mg/mL溶液，将麻醉后大鼠仰卧，四肢、口齿固定于鼠板，以台灯照射其胸部，术者左手持棉纱，右手用套管针将大鼠舌头顶出，左手持棉纱包裹舌头后向上向外拉起，暴露气管开口，将套针插入气管，拔出针芯，以棉丝确定塑料套管位于气管内，抽取配制好的LPS溶液200 ?L，注入气道，拔出套管针，将大鼠直立左右摇摆，使LPS溶液均匀分布于两肺，取下大鼠。
2.2 分组及给药
大鼠随机分为对照组、模型组、治疗组，每组32只。造模第1日起治疗组给予解毒清肺合剂（按1∶1用0.9%氯化钠溶液稀释，1 mL/100 g，每日1次灌胃），模型组灌胃0.9%氯化钠溶液（1 mL/100 g，每日1次灌胃），对照组正常喂养。
2.3 标本采集
实验第10、20、30、40日分期处死各组大鼠，每期24只，每组各8只。麻醉大鼠，仰卧固定于鼠板，开胸暴露肺脏，摘除肺脏，置于4 ℃生理盐水中漂洗2次，取左肺以4%多聚甲醛灌注，放入20倍多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。
2.4 阿尔辛蓝-过碘雪夫染色
连续切片，厚度5 ?m，常规脱蜡至水，蒸馏水洗3次，3%乙酸溶液3 min，1%阿尔辛蓝溶液染色20 min，过碘酸氧化液20 min，自来水充分洗，蒸馏水洗，Schiff液染色20 min，流水冲洗5 min，经95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。各组选取3张切片，每张切片随机选取5个视野，使用Image-Pro Plus 6.0软件计数每个视野下杯状细胞总数。
3 统计学方法
采用SPSS17.0软件进行数据处理。数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，并进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
与对照组相比，模型组、治疗组大鼠从造模第3日开始烟熏时口鼻部黏液分泌明显增多，躁动不安，呼吸急促，收腹、抬头明显。第15日开始模型组以上症状加重，大鼠皮毛光泽减退，体质量减轻。
4.2 病理观察
对照组大鼠气道上皮中蓝色阳性细胞较少，模型组第20日时明显增多，治疗组阳性细胞较对照组增多，随治疗时间延长逐渐减少，至恢复正常。阿尔辛蓝-过碘雪夫（AB-PAS）染色结果见图1。 5 讨论
过多的气道黏液堵塞气道，已成为COPD发病率、死亡率增高的主要原因，而针对气道黏液高分泌的治疗在COPD整体治疗中的作用越来越受到重视。黏液由MUC、水、脂类、糖类、电解质等组成，MUC是其最重要的组成部分。迄今共发现20种MUC基因，其中MUC5AC、MUC5B、MUC2与慢性气道炎症所致的气道黏液高分泌密切相关。AECOPD气道黏液高分泌主要由MUC5AC分泌增多引起，MUC5AC由气道上皮的杯状细胞分泌[6]。因此，可以用杯状细胞的数目变化来反映MUC5AC量的变化，以此衡量药物对AECOPD气道黏液高分泌的影响。
COPD属中医学“肺胀”范畴，本虚标实是其病机主要特点。感邪时以标实为主，有风寒、风热、痰浊、痰热之别；平时以虚为主，当分清肺、脾、肾、心不同脏腑，阴虚、阳虚不同性质。急性期多因外感淫邪、情志不畅或饮食失宜，邪热郁肺，炼液为痰，痰热互结所导致，痰热蕴肺证是其主要的证候。本证候以标实为主，治疗当以清肺化痰、降逆平喘为法。以往中医药研究AECOPD气道黏液高分泌多以单味化痰中药的作用研究为主[7-8]，处方多从清金化痰汤、麻杏石甘汤、越婢加半夏汤、桑白皮汤加减，临床治疗取得显著疗效，并证明可以改善气道黏液高分泌[9]。我们认为痰热藴肺证以热邪、痰邪为患，究其本质，热邪为因、痰邪为果，热邪为本，痰浊为标，因此从其病机出发，通过清肺热、解热毒，以此截断热邪、痰浊间的内在关联，则可热去津化，痰消喘平，减轻气道黏液高分泌。解毒清肺合剂是北京中医药大学东直门医院治疗风温肺热病痰热壅肺证的有效院内制剂[10]，全方以清热解毒、宣肺止咳为基本立法，是在麻杏石甘汤基础上加入桔梗、黄芩、牛蒡子、僵蚕、白花蛇舌草等组成。前期研究结果表明，解毒清肺合剂可以提高巨噬细胞吞噬功能，阻止病毒感染，促进感染恢复[11]，并能提高流感病毒A/PR/8/34（H1N1）感染小白鼠血凝素抗体及神经氨酸酶抗体水平[12]，对于病毒性肺炎、流感等多种温热毒邪所致的肺系感染性疾病有良好的解热止咳、化痰平喘作用。因此我们在此基础上设计了本次实验，以观察解毒清肺合剂对气道黏液高分泌的影响及其作用机理。实验结果表明，使用解毒清肺合剂治疗，可以达到改善气道黏液高分泌的目的，其作用机理与减少模型大鼠气道杯状细胞的化生有关。
本实验从病因病机层面干预气道黏液高分泌，证明了中医辨证论治对于COPD黏液高分泌治疗的有效性和思路的多样性，也说明前期实验使用清热理气化痰中药复方减少黏液高分泌的作用机理绝不仅仅在于化痰药物的使用，其具体作用机理值得进一步研究。
参考文献：
[1] Vestbo J， Prescott E， Lange P. Association of chronic mucus hypersecretion with FEV1 decline and chronic obstructive pulmonary disease morbidity：Copenhagen City Heart Study Group[J]. Am J Respir Crit Care Med，1996，153：1530-1535.
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[9] 李文，毛兵，王刚，等.从气道炎症和气道黏液高分泌研究清热化痰法治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰热阻肺证的机制[J].中西医结合学报，2008，6（8）：799-805.
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[12] 王成祥，王惠芳，沈杏生，等.清肺饮对流感病毒A/PR/8/34（H1N1）感染小白鼠血凝素抗体、神经氨酸酶抗体的影响[J].中国中药杂志，2004，
29（2）：100-101.
（收稿日期：2012-04-02，编辑：华强）