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摘要：目的 观察远志皂苷元对阿尔茨海默（AD）大鼠模型海马tau蛋白磷酸化相关酶类表达的影响，并探讨其机理。方法 清洁级SD雄性大鼠60只，随机分为对照组、模型组、多奈哌齐组及远志皂苷元低、中、高剂量组，每组10只。侧脑室注射寡聚体形式的β淀粉样蛋白（Aβ）1-42制备AD大鼠模型，术后给药组给予不同剂量远志皂苷元和多奈哌齐灌胃，对照组和AD模型组给予等量生理盐水灌胃。应用免疫组织化学方法和蛋白印迹法检测海马tau蛋白激酶（GSK-3β、CDK-5）和磷酸酯酶（PP-1、PP-2A）的表达水平。结果 与对照组比较，模型组tau蛋白激酶表达明显升高，磷酸酯酶表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，远志皂苷元各剂量组蛋白激酶表达明显降低，磷酸酯酶表达明显升高（P<0.01）。结论 远志皂苷元能调节AD大鼠模型蛋白激酶和磷酸酯酶之间的平衡失调。
关键词：tau蛋白；磷酸化；远志皂苷元；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）09-0045-03
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）以神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）和神经炎性斑块（neuritic plaque，NP）为主要病理改变。NFTs与AD患者的痴呆症状密切相关[1]，主要由双螺旋丝（pair helical filament，PHF）和营养不良性轴突构成，PHF主要包含高度磷酸化的tau蛋白，因此tau蛋白高度磷酸化是引起AD神经原纤维退行性改变的主要变化[2]。
本研究采用侧脑室注射β淀粉样蛋白（Aβ）1-42大鼠为模型，观察远志皂苷元对tau蛋白激酶和磷酸酯酶活性的影响。
1 实验方法
1.1 动物
清洁级SD雄性大鼠60只，体质量（250±20）g，购自北京维通利华实验动物中心，合格证号：SCXK（京）2007-0001。大鼠分笼饲养于日照/黑暗为12 h/12 h的恒温环境，自由摄食和饮水。
1.2 主要试剂及仪器
Aβ1-42（美国Chemicon公司），一抗GSK-3β、CDK-5、PP-1和PP-2A购自北京中杉金桥生物技术有限公司），辣根过氧化物酶标记的二抗（北京博奥森公司），其他试剂均购自北京化学试剂公司。
1.3 药物
远志皂苷元购自四川维克奇生物科技有限公司（批号11176240003），多奈哌齐购自卫材中国药业有限公司（批号100307A）。
2 实验方法
2.1 分组
根据随机数字表将大鼠随机分为对照组、模型组、多奈哌齐组[0.33 mg/（kg·d）]及远志皂苷元低[500 mg/（kg·d）]、中[750 mg/k（g·d）]、高[1 000 mg/（kg·d）]剂量组，每组10只。
2.2 造模与给药
将粉末状Aβ1-42溶于生理盐水配制成浓度为1 ?g/?L溶液，37 ℃孵育3 d使其变为寡聚体形式。给大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/mg）麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪上，暴露前囟，选取前囟向后1.0 mm、向右旁开1.5 mm作为右侧脑室体表穿刺点，用微量进样器自脑表面垂直进针4.0 mm，以1 ?L/min速度缓慢将10 ?L寡聚态Aβ1-42注入侧脑室，注射后留针10 min以使Aβ充分弥散，然后缓慢退针，缝合切口，肌肉注射青霉素20万U预防感染。造模成功后，给药组大鼠分别给予不同剂量远志皂苷元和多奈哌齐灌胃，对照组和模型组给以等量生理盐水灌胃，每日1次，灌胃至1个月时进行免疫组织化学染色和蛋白质印迹分析。
2.3 免疫组化染色
各组大鼠以10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，左心室插管，同时剪开右心耳，生理盐水灌注，直至眼球、肝脏变白，继以4%中性多聚甲醛灌注固定，迅速取脑，放入含有30%蔗糖的中性多聚甲醛溶液中后固定，待脑组织下沉后，进行冰冻切片，免疫组织化学染色。
采用抗生物素蛋白-生物复合物（ABC）法行免疫组织化学染色，对蛋白激酶GSK-3β和CDK-5、磷酸酯酶PP-1和PP2A的表达进行测定。首先用3%H2O2处理脑片10 min以消除内源性过氧化物酶的影响，然后用5%的山羊血清封闭30 min以消除不确定的抗原。加入兔抗GSK-3β（1∶50）、CDK-5（1∶100）、PP-1（1∶100）和PP2A（1∶100）孵育后，用生物素化的抗兔IgG（1∶200）孵育2 h，然后再用辣根酶标记的链霉卵白素（1∶200）室温孵育2 h，最后与二氨基联苯胺（DAB）显色，光镜下观察，自来水充分冲洗终止，中性树脂封片。采用Kodak图像分析系统及Image-Proplus软件，在10倍物镜下，计算各组海马CA1区域内阳性神经元的表达数目。
2.4 蛋白质印迹分析
将大鼠麻醉后处死，迅速取出双侧海马，称重，按1 ?g/10 ?L的比例加入组织匀浆液进行匀浆后，置于4 ℃离心机内13 000 r/min离心30 min，取上清，检测蛋白浓度，剩余的保存于-70 ℃备用。用前加5×上样缓冲液并混匀，于100 ℃变性5 min。样品蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至NC膜，封闭2 h，分别加入一抗和二抗孵育后，应用化学发光法显影。
3 统计学方法
使用SPSS11.0统计软件进行统计分析，实验数据用—x±s表示，组间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果（见图1、表1）
5 讨论
tau蛋白是一种脑特异性的微管相关蛋白，具有促微管组装和维持微管稳定的重要作用，其功能主要受磷酸化调节。作为一种磷蛋白，在体内外tau蛋白均可被多种蛋白激酶和磷酸酯酶作用，改变其磷酸化状态[3-4]。在AD患者脑中，tau蛋白被异常过度磷酸化，丧失其生物学功能，并自身聚合为成对螺旋细丝，进而形成AD特异性病理改变——NFTs[5]。 tau蛋白的异常磷酸化修饰在AD及其他一些急慢性神经退行性疾病发病中起重要作用，tau蛋白过度磷酸化不仅使其本身促微管组装活性降低，还通过消耗正常tau蛋白和其他微管相关蛋白进一步破坏微管结构，引起轴浆转运障碍，神经元突起断裂，神经元变性解体，继而发生退行性改变，形成NFTs。由NFTs引起的神经元纤维退化在AD发病中起重要作用，与其临床痴呆症状呈平行关系。
蛋白激酶和磷酸酯酶表达平衡对于维持tau蛋白的正常磷酸化具有重要意义。正常情况下，蛋白激酶和磷酸酯酶能够保持动态平衡，各种原因导致蛋白激酶活性升高和/或磷酸酯酶活性下降均会引起tau蛋白发生过度磷酸化。在众多蛋白激酶中，CDK-5和GSK-3β对tau 的磷酸化效率最高[6-8]。磷酸酯酶的作用是催化tau蛋白脱磷酸基，其中活性最强的是PP-2A和PP-1。从调节蛋白激酶和磷酸酯酶的角度改变tau蛋白磷酸化状态也许有助于防治tau蛋白参与的某些神经退行性疾病。
AD属于中医“呆证”、“健忘”等范畴，其发病与虚、痰、瘀三者相关。肾虚为本，痰瘀互阻为标，病位在脑，与心、肝、肾密切相关[9]。肾为先天之本，藏精养神，脑为元神之府，灵机记性皆在脑中。肾精亏虚、脑窍失养、心不藏神、肝失疏泄、痰浊瘀血痹阻经脉均可致神明失养，出现学习记忆及精神等方面的障碍。远志为远志科多年生草本植物远志和卵叶远志的根，具有宁心安神、祛痰开窍、消散痈肿的功效。远志为药，早在《神农本草经》就有记载，李时珍在《本草纲目》称“此草服之能益智强志，故有远志之称”。药王孙思邈将远志列为益智方药的第一味。可见自古医家就把远志当成延年益智的良药。远志成分复杂，远志皂苷元为其主要活性成分之一。研究表明，远志皂苷元在抗衰老、益智、抗氧化等方面显示出独特的药理活性[10]。能够通过抗氧化、清除自由基[11]降低AchE活性，提高脑组织Ach含量，改善老化模型小鼠的学习记忆能力。远志皂苷元能有效预防Aβ对神经元的毒性作用[12]。另外本课题组研究发现，远志皂苷元能够显著对抗二羰基化合物诱导的海马神经元损伤[13]。
本研究采用侧脑室注射Aβ1-42建立AD大鼠模型，通过免疫组化方法检测远志皂苷元对AD大鼠海马神经元tau蛋白磷酸化相关酶类表达的影响，结果显示，AD大鼠海马神经元存在GSK-3β和CDK-5表达异常增高，而PP-1和PP-2A表达下降，经过远志皂苷元治疗后，GSK-3β和CDK-5明显降低，PP-1和PP-2A表达有所升高，说明远志皂苷元可在一定程度上调节蛋白激酶和磷酸酯酶的平衡。下一步我们将继续深入观察远志皂苷元对tau蛋白磷酸化位点的影响。
参考文献：
[1] Giannakopoulos P， Herrmann FR， Bussi?re T， et al. Tangle and neuron numbers， but not amyloid loads， predict cognitive status in Alzheimer’s disease[J]. Neurology，2003，60（9）：1495-1500.
[2] Morishima-Kawashima M， Hasegawa M， Takio K， et al. Proline- directed and non-proline-directed phosphorylation of PHF-Tau[J]. J Biol Chem，1995，270（2）：823-829.
[3] Gong CX， Lidsky T， Wegiel J， et al. Phosphorylation of microtubule-associated protein tau is regulated by protein phosphatase 2A in mammalian brain[J]. J Biol Chem，2000，275（8）：5535-5544.
[4] Saito T， Ishiguro K， Uchida T， et al. In situ dephosphorylation of tau by protein phosphatase 2A and 2B in fetal rat primary cultured neurons[J]. FEBS Letters，1995，376（3）：238-242.
[5] Wang JZ， Gong CX， Zaidi T， et al. Dephosphorylation of Alzheimer paired helical filaments by PP-2A and PP-2B[J]. J Biochem，1995， 270（9）：4854-4860.
[6] Gong CX， Liu F， Grundke-Iqbal I， et al. Post-translational modifications of tau protein in Alzheimer’s disease[J]. Neural Transm，2005，112（6）：813-838.
[7] Pei JJ， Braa KE， Braak H， et al. Distribution of active glycogen synthase kinase-3 beta （GSK-3beta） in brain staged for Alzheimer’s disease neurofibrillary changes[J]. J Neuropathol Exp Neurol， 1999，58（9）：1010-1019.
[8] 丁绍红，施建华，尹晓敏，等.PKA、GSK-3β和cdk5对微管相关蛋白tau的位点特异性磷酸化[J].南通大学学报，2006，26（4）：235-238.
[9] 尹宗宁.中医药防治老年痴呆症的研究进展[J].中国老年学杂志， 2005，25（3）：354.
[10] 姜勇，屠鹏飞.远志研究进展[J].中草药，2001，32（8）：759-761.
[11] 孙桂波，邓响潮，李楚华.远志皂苷对H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用[J].中药材，2007，30（8）：991-993.
[12] Chen Q， Cao YG， Zhang CH. Effect of tenuigenin on cholinergic decline induced by β-amyloid peptide and ibotenic acid in rats[J]. Acta Pharm Sin，2002，37（12）：913.
[13] Chen Y， Huang X， Li L， et al. Tenuigenin protects cultured hippocampal neurons against methylglyoxal-induced neurotoxicity[J]. Eur J Pharmacol，2010，645（1-3）：1-8.
（收稿日期：2012-02-26，编辑：华强）
关键词：tau蛋白；磷酸化；远志皂苷元；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）09-0045-03
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）以神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）和神经炎性斑块（neuritic plaque，NP）为主要病理改变。NFTs与AD患者的痴呆症状密切相关[1]，主要由双螺旋丝（pair helical filament，PHF）和营养不良性轴突构成，PHF主要包含高度磷酸化的tau蛋白，因此tau蛋白高度磷酸化是引起AD神经原纤维退行性改变的主要变化[2]。
本研究采用侧脑室注射β淀粉样蛋白（Aβ）1-42大鼠为模型，观察远志皂苷元对tau蛋白激酶和磷酸酯酶活性的影响。
1 实验方法
1.1 动物
清洁级SD雄性大鼠60只，体质量（250±20）g，购自北京维通利华实验动物中心，合格证号：SCXK（京）2007-0001。大鼠分笼饲养于日照/黑暗为12 h/12 h的恒温环境，自由摄食和饮水。
1.2 主要试剂及仪器
Aβ1-42（美国Chemicon公司），一抗GSK-3β、CDK-5、PP-1和PP-2A购自北京中杉金桥生物技术有限公司），辣根过氧化物酶标记的二抗（北京博奥森公司），其他试剂均购自北京化学试剂公司。
1.3 药物
远志皂苷元购自四川维克奇生物科技有限公司（批号11176240003），多奈哌齐购自卫材中国药业有限公司（批号100307A）。
2 实验方法
2.1 分组
根据随机数字表将大鼠随机分为对照组、模型组、多奈哌齐组[0.33 mg/（kg·d）]及远志皂苷元低[500 mg/（kg·d）]、中[750 mg/k（g·d）]、高[1 000 mg/（kg·d）]剂量组，每组10只。
2.2 造模与给药
将粉末状Aβ1-42溶于生理盐水配制成浓度为1 ?g/?L溶液，37 ℃孵育3 d使其变为寡聚体形式。给大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/mg）麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪上，暴露前囟，选取前囟向后1.0 mm、向右旁开1.5 mm作为右侧脑室体表穿刺点，用微量进样器自脑表面垂直进针4.0 mm，以1 ?L/min速度缓慢将10 ?L寡聚态Aβ1-42注入侧脑室，注射后留针10 min以使Aβ充分弥散，然后缓慢退针，缝合切口，肌肉注射青霉素20万U预防感染。造模成功后，给药组大鼠分别给予不同剂量远志皂苷元和多奈哌齐灌胃，对照组和模型组给以等量生理盐水灌胃，每日1次，灌胃至1个月时进行免疫组织化学染色和蛋白质印迹分析。
2.3 免疫组化染色
各组大鼠以10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，左心室插管，同时剪开右心耳，生理盐水灌注，直至眼球、肝脏变白，继以4%中性多聚甲醛灌注固定，迅速取脑，放入含有30%蔗糖的中性多聚甲醛溶液中后固定，待脑组织下沉后，进行冰冻切片，免疫组织化学染色。
采用抗生物素蛋白-生物复合物（ABC）法行免疫组织化学染色，对蛋白激酶GSK-3β和CDK-5、磷酸酯酶PP-1和PP2A的表达进行测定。首先用3%H2O2处理脑片10 min以消除内源性过氧化物酶的影响，然后用5%的山羊血清封闭30 min以消除不确定的抗原。加入兔抗GSK-3β（1∶50）、CDK-5（1∶100）、PP-1（1∶100）和PP2A（1∶100）孵育后，用生物素化的抗兔IgG（1∶200）孵育2 h，然后再用辣根酶标记的链霉卵白素（1∶200）室温孵育2 h，最后与二氨基联苯胺（DAB）显色，光镜下观察，自来水充分冲洗终止，中性树脂封片。采用Kodak图像分析系统及Image-Proplus软件，在10倍物镜下，计算各组海马CA1区域内阳性神经元的表达数目。
2.4 蛋白质印迹分析
将大鼠麻醉后处死，迅速取出双侧海马，称重，按1 ?g/10 ?L的比例加入组织匀浆液进行匀浆后，置于4 ℃离心机内13 000 r/min离心30 min，取上清，检测蛋白浓度，剩余的保存于-70 ℃备用。用前加5×上样缓冲液并混匀，于100 ℃变性5 min。样品蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至NC膜，封闭2 h，分别加入一抗和二抗孵育后，应用化学发光法显影。
3 统计学方法
使用SPSS11.0统计软件进行统计分析，实验数据用—x±s表示，组间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果（见图1、表1）
5 讨论
tau蛋白是一种脑特异性的微管相关蛋白，具有促微管组装和维持微管稳定的重要作用，其功能主要受磷酸化调节。作为一种磷蛋白，在体内外tau蛋白均可被多种蛋白激酶和磷酸酯酶作用，改变其磷酸化状态[3-4]。在AD患者脑中，tau蛋白被异常过度磷酸化，丧失其生物学功能，并自身聚合为成对螺旋细丝，进而形成AD特异性病理改变——NFTs[5]。 tau蛋白的异常磷酸化修饰在AD及其他一些急慢性神经退行性疾病发病中起重要作用，tau蛋白过度磷酸化不仅使其本身促微管组装活性降低，还通过消耗正常tau蛋白和其他微管相关蛋白进一步破坏微管结构，引起轴浆转运障碍，神经元突起断裂，神经元变性解体，继而发生退行性改变，形成NFTs。由NFTs引起的神经元纤维退化在AD发病中起重要作用，与其临床痴呆症状呈平行关系。
蛋白激酶和磷酸酯酶表达平衡对于维持tau蛋白的正常磷酸化具有重要意义。正常情况下，蛋白激酶和磷酸酯酶能够保持动态平衡，各种原因导致蛋白激酶活性升高和/或磷酸酯酶活性下降均会引起tau蛋白发生过度磷酸化。在众多蛋白激酶中，CDK-5和GSK-3β对tau 的磷酸化效率最高[6-8]。磷酸酯酶的作用是催化tau蛋白脱磷酸基，其中活性最强的是PP-2A和PP-1。从调节蛋白激酶和磷酸酯酶的角度改变tau蛋白磷酸化状态也许有助于防治tau蛋白参与的某些神经退行性疾病。
AD属于中医“呆证”、“健忘”等范畴，其发病与虚、痰、瘀三者相关。肾虚为本，痰瘀互阻为标，病位在脑，与心、肝、肾密切相关[9]。肾为先天之本，藏精养神，脑为元神之府，灵机记性皆在脑中。肾精亏虚、脑窍失养、心不藏神、肝失疏泄、痰浊瘀血痹阻经脉均可致神明失养，出现学习记忆及精神等方面的障碍。远志为远志科多年生草本植物远志和卵叶远志的根，具有宁心安神、祛痰开窍、消散痈肿的功效。远志为药，早在《神农本草经》就有记载，李时珍在《本草纲目》称“此草服之能益智强志，故有远志之称”。药王孙思邈将远志列为益智方药的第一味。可见自古医家就把远志当成延年益智的良药。远志成分复杂，远志皂苷元为其主要活性成分之一。研究表明，远志皂苷元在抗衰老、益智、抗氧化等方面显示出独特的药理活性[10]。能够通过抗氧化、清除自由基[11]降低AchE活性，提高脑组织Ach含量，改善老化模型小鼠的学习记忆能力。远志皂苷元能有效预防Aβ对神经元的毒性作用[12]。另外本课题组研究发现，远志皂苷元能够显著对抗二羰基化合物诱导的海马神经元损伤[13]。
本研究采用侧脑室注射Aβ1-42建立AD大鼠模型，通过免疫组化方法检测远志皂苷元对AD大鼠海马神经元tau蛋白磷酸化相关酶类表达的影响，结果显示，AD大鼠海马神经元存在GSK-3β和CDK-5表达异常增高，而PP-1和PP-2A表达下降，经过远志皂苷元治疗后，GSK-3β和CDK-5明显降低，PP-1和PP-2A表达有所升高，说明远志皂苷元可在一定程度上调节蛋白激酶和磷酸酯酶的平衡。下一步我们将继续深入观察远志皂苷元对tau蛋白磷酸化位点的影响。
参考文献：
[1] Giannakopoulos P， Herrmann FR， Bussi?re T， et al. Tangle and neuron numbers， but not amyloid loads， predict cognitive status in Alzheimer’s disease[J]. Neurology，2003，60（9）：1495-1500.
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[3] Gong CX， Lidsky T， Wegiel J， et al. Phosphorylation of microtubule-associated protein tau is regulated by protein phosphatase 2A in mammalian brain[J]. J Biol Chem，2000，275（8）：5535-5544.
[4] Saito T， Ishiguro K， Uchida T， et al. In situ dephosphorylation of tau by protein phosphatase 2A and 2B in fetal rat primary cultured neurons[J]. FEBS Letters，1995，376（3）：238-242.
[5] Wang JZ， Gong CX， Zaidi T， et al. Dephosphorylation of Alzheimer paired helical filaments by PP-2A and PP-2B[J]. J Biochem，1995， 270（9）：4854-4860.
[6] Gong CX， Liu F， Grundke-Iqbal I， et al. Post-translational modifications of tau protein in Alzheimer’s disease[J]. Neural Transm，2005，112（6）：813-838.
[7] Pei JJ， Braa KE， Braak H， et al. Distribution of active glycogen synthase kinase-3 beta （GSK-3beta） in brain staged for Alzheimer’s disease neurofibrillary changes[J]. J Neuropathol Exp Neurol， 1999，58（9）：1010-1019.
[8] 丁绍红，施建华，尹晓敏，等.PKA、GSK-3β和cdk5对微管相关蛋白tau的位点特异性磷酸化[J].南通大学学报，2006，26（4）：235-238.
[9] 尹宗宁.中医药防治老年痴呆症的研究进展[J].中国老年学杂志， 2005，25（3）：354.
[10] 姜勇，屠鹏飞.远志研究进展[J].中草药，2001，32（8）：759-761.
[11] 孙桂波，邓响潮，李楚华.远志皂苷对H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用[J].中药材，2007，30（8）：991-993.
[12] Chen Q， Cao YG， Zhang CH. Effect of tenuigenin on cholinergic decline induced by β-amyloid peptide and ibotenic acid in rats[J]. Acta Pharm Sin，2002，37（12）：913.
[13] Chen Y， Huang X， Li L， et al. Tenuigenin protects cultured hippocampal neurons against methylglyoxal-induced neurotoxicity[J]. Eur J Pharmacol，2010，645（1-3）：1-8.
（收稿日期：2012-02-26，编辑：华强）