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摘要：目的 探讨足三里穴位注射硫普罗宁治疗非酒精性脂肪肝的作用机制。方法 将32只SD大鼠随机分为正常组、模型组、腹腔注射组、穴位注射组，除正常组外，剩余24只大鼠用高脂饲料诱导大鼠高脂性脂肪肝模型。造模成功后，腹腔注射组、穴位注射组按80 mg/（kg·d）予腹腔内及足三里注射硫普罗宁，治疗6周。正常组、模型组不做任何处理。第6周末处死全部大鼠。检测各组大鼠血清谷氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性，采用CHOD-PAP法测定血清和肝组织胆固醇（TC），采用GPO-PAP法测定血清和肝组织三酰甘油（TG）。结果 模型组血清AST、ALT、TC、TG明显升高（P<0.01），肝组织TC、TG升高（P<0.05）；腹腔注射组治疗后与模型组比较差异无统计学意义；与模型组、腹腔注射组比较，穴位注射组能明显改善脂肪变性，降低肝脏炎症反应，降低大鼠TG、TC、ALT、AST水平（P<0.05）。结论 足三里穴位注射硫普罗宁能明显非酒精性脂肪肝大鼠降低血脂、肝脂，保护肝细胞。
关键词：硫普罗宁；足三里；穴位注射；非酒精性脂肪性肝；大鼠
中图分类号：R245.95 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）09-0030-03
非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD）是一种无过量饮酒史的以弥漫性肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为主要特征的临床病理综合征。目前，NAFLD是导致无症状性转氨酶升高的首要病因，而且有部分患者会进展至终末期肝病，有些与肝脏肿瘤有关。我国NAFLD的患病率在15%～20%之间[1]，已成为危害人类健康的三大肝病之一。文献报道，硫普罗宁对病毒性、药物性肝损伤、脂肪肝和稳定期肝硬化有很好的疗效[2]。笔者观察足三里穴位注射硫普罗宁对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能及脂质代谢的影响，旨在揭示硫普罗宁足三里穴位注射抗脂肪肝的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD大鼠32只，雌雄各半，体质量180～220 g，甘肃中医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（甘）2004-0006- 0000811。动物分组饲养在笼内，实验环境设施SPF级，室温19～25 ℃，相对湿度40%～65%。实验动物遵循动物实验3R原则。
1.2 药物及试剂
注射用硫普罗宁，0.1 g/支，河南省新谊药业股份公司，批号20110526。胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）测定试剂盒，北京福瑞生物工程公司，批号10042102。谷氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号100423。
1.3 饲料
SPF高脂饲料委托北京科澳协力饲料有限公司加工生产，许可证号：SCXK（京）2005-0007-0132722。
1.4 仪器
组织包埋机（日本Tissue-Tek TECTM 5），展片器、脱水机（日本SAKURA），石蜡切片机（IVS-410日本），荧光分光光度计（日本岛津公司），全自动生化分析仪（美国雅培公司）；低温高速离心机（Biofuge fresco美国），电子天平FA2004（上海精天天平厂），79HW-1恒温磁力搅拌器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）。恒温水浴箱；医用超净工作台、各种规格加样器。
2 实验方法
2.1 分组
根据本研究预实验结果做适当调整，大鼠适应性饲养1周，确认健康后，采用配伍设计分组方法。将32只大鼠按体质量编号，体质量相近的4只大鼠配成一个区组，分为8个区组，每组4只，再利用4×4随机化拉丁方，任意指定一行，每行只取随机数1～4，舍去其余随机数字，依次标于各区组受试大鼠编号下，预先规定随机数字1、2、3、4分别归入正常组、模型组、腹腔注射组、穴位注射组4个处理组。每组8只。32只大鼠分笼喂养于8个等大的大鼠喂养笼中，每笼4只，雌雄分笼饲养。
2.2 造模
自实验开始起，正常组采用基础饲料喂养，其余3组均予高脂饲料喂养建立高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠模型[3]。高脂饲料为82.3%基础饲料加10%猪油、5%蔗糖、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙硫氧嘧啶片（50 mg/片）。高脂饲料喂养2周后，预实验表明：模型组与正常组比较肝脏体积明显增大，呈黄褐色，触之有油腻感，边缘饱满，质地稍韧，组织学检查肝细胞普遍发生中至重度脂肪变性，肝索排列紊乱，无放射状排列，肝细胞浊肿，胞浆内充满着大量大小不等的脂滴；一些肝细胞核则被脂肪滴挤得明显偏位；肝细胞内可见中性粒细胞浸润，部分肝细胞出现点状坏死，汇管区大量炎细胞浸润。造模成功，模型组改为基础饲料喂养，不用药物治疗；腹腔注射组以及穴位注射组改为基础饲料喂养，同时给予硫普罗宁治疗，共6周。实验动物自由饮水和进食，喂养至8周末最后一次给药，禁食12 h处死取材。每日测定大鼠的摄食量，每周测定大鼠体质量。
2.3 给药
根据公式[大鼠剂量=人剂量×35（人转换因子）/6（大鼠转换因子）]计算出人鼠等效剂量：硫普罗宁80 mg/（kg·d）。各治疗组均于造模成功后即开始治疗。穴位注射组参照文献[3]大鼠针灸穴位定位足三里：后腿前，膝关节后外侧，在腓骨小头下5 mm靠近胫骨外侧；腹腔注射组予腹腔注射。用皮试注射器，按80 mg/（kg·d）抽取药液，常规消毒，回抽无血，于穴位和腹腔内注入，连续6 d后休息1 d，共治疗6周。正常组、模型组不做处理。
2.4 取材及检测
2.4.1 血清制备及检测 造模用药至8周末，大鼠先行禁食12 h，然后将各组大鼠标记，称重后用1%戊巴比妥钠30 mg/kg鼠重，腹腔内注射麻醉。大鼠麻醉后行上腹正中直行切口入腹，打开腹腔，经腹腔动脉取血5 mL，静置30 min后3 000 r/min离心15 min，分离血清装于1.5 mL的离心管中2～4 ℃冷藏保存，按试剂盒方法，于全自动生化分析仪雅培公司ALCYON 300测ALT、AST、TC、TG。 2.4.2 肝组织匀浆制备及检测 自肝右叶取新鲜肝组织250 mg，用氯仿-乙醇（2∶1，V/V）混合液在4 ℃下制成5%的肝匀浆，静置48 h，3 000 r/min，离心15 min，提取上清液，用CHOD-PAP法测定肝组织匀浆TC，用GPO-PAP法测定肝组织TG。
2.5 一般情况观察
分别于实验前后用电子称称量各组大鼠的体质量，观察精神、运动、饮食、排便、皮毛色泽等情况。
3 统计学方法
用SPSS13.0软件包进行统计学分析，计量资料用—x±s表示。多组计量资料分析采用方差分析，多重比较采用LSD；多组等级资料分析采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Nemenyi法。P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
整个实验过程中，各组大鼠均无死亡。正常组大鼠精力充沛，灵活好动，饮食正常，皮毛光滑；模型组大鼠精神萎靡，性情较温顺，不喜动，皮毛凌乱欠光泽；用药组大鼠均有不同程度的活动及饮食减少，皮毛欠光泽。
4.2 生化指标检测结果（见表1、表2）
5 讨论
足三里是足阳明胃经合穴，有调理中焦、疏通经络、扶正祛邪的功效。足三里对消化系统有明显的调整作用，且能有效提高细胞免疫功能。研究表明，针灸对肝功能的影响是多方面的，其中足三里的特异性发挥了重要作用[5]。
硫普罗宁为甘氨酸衍生物，能加快乙醇和乙醛的降解和排泄，阻止TG在肝内的沉积和成纤维细胞的增生，可阻断并逆转非酒精性肝损伤[2]。
血清转氨酶包括ALT和AST，是反映肝细胞损害的重要指标，是非特异性细胞内功能酶，正常时血清内含量很低，当肝脏细胞受损伤，肝细胞膜的通透性亢进时，其活性迅速增加。ALT、AST增高情况可反映出肝细胞损伤和坏死程度。本实验结果表明：模型组大鼠血清ALT、AST均显著高于正常组（P<0.01）；穴位注射组大鼠血清ALT、AST显著低于模型组、腹腔注射组（P<0.05）。说明非酒精性脂肪肝时大鼠肝脏功能有显著的损伤及坏死，而穴位注射硫普罗宁可显著降低转氨酶，有保护肝脏的作用。
机体脂类代谢失调是诱发脂肪肝的重要因素，通常被认为是形成脂肪肝的第一次打击。TC、TG的测定可直接反映血清中脂质的水平。本实验研究表明：模型组TG、TC高于正常组（P<0.05， P<0.01）；足三里穴位注射组降肝脂、血脂效果优于腹腔注射组（P<0.05）。说明非酒精性脂肪肝与脂质代谢异常密切相关，而足三里穴位注射可以通过有效降低血清TC、TG含量而降低血浆中脂质水平，促进TC、TG代谢达到减轻肝脏脂肪蓄积的目的。
参考文献：
[1] 范建高.非酒精性脂肪性肝病的流行率[J].中国医师进修杂志：内科版，2006，29（9）：1-2.
[2] 邬亚妙.硫普罗宁对非酒精性脂肪性肝病的疗效[J].现代实用医学， 2003，15（9）：582.
[3] 段斐，刘晋芝，孙晓芳，等.大鼠高脂性脂肪肝模型快速制造方法[J].河北职工医学院学报，2003，20（4）：1-2.
[4] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：327-329.
[5] 金建军，徐亚莉，郑昱.穴位注射对非酒精性脂肪肝血脂代谢及肝功能的影响[J].中国针灸，2006，26（2）：100-102.
（收稿日期：2012-02-20，编辑：华强）
关键词：硫普罗宁；足三里；穴位注射；非酒精性脂肪性肝；大鼠
中图分类号：R245.95 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）09-0030-03
非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD）是一种无过量饮酒史的以弥漫性肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为主要特征的临床病理综合征。目前，NAFLD是导致无症状性转氨酶升高的首要病因，而且有部分患者会进展至终末期肝病，有些与肝脏肿瘤有关。我国NAFLD的患病率在15%～20%之间[1]，已成为危害人类健康的三大肝病之一。文献报道，硫普罗宁对病毒性、药物性肝损伤、脂肪肝和稳定期肝硬化有很好的疗效[2]。笔者观察足三里穴位注射硫普罗宁对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能及脂质代谢的影响，旨在揭示硫普罗宁足三里穴位注射抗脂肪肝的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD大鼠32只，雌雄各半，体质量180～220 g，甘肃中医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（甘）2004-0006- 0000811。动物分组饲养在笼内，实验环境设施SPF级，室温19～25 ℃，相对湿度40%～65%。实验动物遵循动物实验3R原则。
1.2 药物及试剂
注射用硫普罗宁，0.1 g/支，河南省新谊药业股份公司，批号20110526。胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）测定试剂盒，北京福瑞生物工程公司，批号10042102。谷氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号100423。
1.3 饲料
SPF高脂饲料委托北京科澳协力饲料有限公司加工生产，许可证号：SCXK（京）2005-0007-0132722。
1.4 仪器
组织包埋机（日本Tissue-Tek TECTM 5），展片器、脱水机（日本SAKURA），石蜡切片机（IVS-410日本），荧光分光光度计（日本岛津公司），全自动生化分析仪（美国雅培公司）；低温高速离心机（Biofuge fresco美国），电子天平FA2004（上海精天天平厂），79HW-1恒温磁力搅拌器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）。恒温水浴箱；医用超净工作台、各种规格加样器。
2 实验方法
2.1 分组
根据本研究预实验结果做适当调整，大鼠适应性饲养1周，确认健康后，采用配伍设计分组方法。将32只大鼠按体质量编号，体质量相近的4只大鼠配成一个区组，分为8个区组，每组4只，再利用4×4随机化拉丁方，任意指定一行，每行只取随机数1～4，舍去其余随机数字，依次标于各区组受试大鼠编号下，预先规定随机数字1、2、3、4分别归入正常组、模型组、腹腔注射组、穴位注射组4个处理组。每组8只。32只大鼠分笼喂养于8个等大的大鼠喂养笼中，每笼4只，雌雄分笼饲养。
2.2 造模
自实验开始起，正常组采用基础饲料喂养，其余3组均予高脂饲料喂养建立高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠模型[3]。高脂饲料为82.3%基础饲料加10%猪油、5%蔗糖、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙硫氧嘧啶片（50 mg/片）。高脂饲料喂养2周后，预实验表明：模型组与正常组比较肝脏体积明显增大，呈黄褐色，触之有油腻感，边缘饱满，质地稍韧，组织学检查肝细胞普遍发生中至重度脂肪变性，肝索排列紊乱，无放射状排列，肝细胞浊肿，胞浆内充满着大量大小不等的脂滴；一些肝细胞核则被脂肪滴挤得明显偏位；肝细胞内可见中性粒细胞浸润，部分肝细胞出现点状坏死，汇管区大量炎细胞浸润。造模成功，模型组改为基础饲料喂养，不用药物治疗；腹腔注射组以及穴位注射组改为基础饲料喂养，同时给予硫普罗宁治疗，共6周。实验动物自由饮水和进食，喂养至8周末最后一次给药，禁食12 h处死取材。每日测定大鼠的摄食量，每周测定大鼠体质量。
2.3 给药
根据公式[大鼠剂量=人剂量×35（人转换因子）/6（大鼠转换因子）]计算出人鼠等效剂量：硫普罗宁80 mg/（kg·d）。各治疗组均于造模成功后即开始治疗。穴位注射组参照文献[3]大鼠针灸穴位定位足三里：后腿前，膝关节后外侧，在腓骨小头下5 mm靠近胫骨外侧；腹腔注射组予腹腔注射。用皮试注射器，按80 mg/（kg·d）抽取药液，常规消毒，回抽无血，于穴位和腹腔内注入，连续6 d后休息1 d，共治疗6周。正常组、模型组不做处理。
2.4 取材及检测
2.4.1 血清制备及检测 造模用药至8周末，大鼠先行禁食12 h，然后将各组大鼠标记，称重后用1%戊巴比妥钠30 mg/kg鼠重，腹腔内注射麻醉。大鼠麻醉后行上腹正中直行切口入腹，打开腹腔，经腹腔动脉取血5 mL，静置30 min后3 000 r/min离心15 min，分离血清装于1.5 mL的离心管中2～4 ℃冷藏保存，按试剂盒方法，于全自动生化分析仪雅培公司ALCYON 300测ALT、AST、TC、TG。 2.4.2 肝组织匀浆制备及检测 自肝右叶取新鲜肝组织250 mg，用氯仿-乙醇（2∶1，V/V）混合液在4 ℃下制成5%的肝匀浆，静置48 h，3 000 r/min，离心15 min，提取上清液，用CHOD-PAP法测定肝组织匀浆TC，用GPO-PAP法测定肝组织TG。
2.5 一般情况观察
分别于实验前后用电子称称量各组大鼠的体质量，观察精神、运动、饮食、排便、皮毛色泽等情况。
3 统计学方法
用SPSS13.0软件包进行统计学分析，计量资料用—x±s表示。多组计量资料分析采用方差分析，多重比较采用LSD；多组等级资料分析采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Nemenyi法。P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
整个实验过程中，各组大鼠均无死亡。正常组大鼠精力充沛，灵活好动，饮食正常，皮毛光滑；模型组大鼠精神萎靡，性情较温顺，不喜动，皮毛凌乱欠光泽；用药组大鼠均有不同程度的活动及饮食减少，皮毛欠光泽。
4.2 生化指标检测结果（见表1、表2）
5 讨论
足三里是足阳明胃经合穴，有调理中焦、疏通经络、扶正祛邪的功效。足三里对消化系统有明显的调整作用，且能有效提高细胞免疫功能。研究表明，针灸对肝功能的影响是多方面的，其中足三里的特异性发挥了重要作用[5]。
硫普罗宁为甘氨酸衍生物，能加快乙醇和乙醛的降解和排泄，阻止TG在肝内的沉积和成纤维细胞的增生，可阻断并逆转非酒精性肝损伤[2]。
血清转氨酶包括ALT和AST，是反映肝细胞损害的重要指标，是非特异性细胞内功能酶，正常时血清内含量很低，当肝脏细胞受损伤，肝细胞膜的通透性亢进时，其活性迅速增加。ALT、AST增高情况可反映出肝细胞损伤和坏死程度。本实验结果表明：模型组大鼠血清ALT、AST均显著高于正常组（P<0.01）；穴位注射组大鼠血清ALT、AST显著低于模型组、腹腔注射组（P<0.05）。说明非酒精性脂肪肝时大鼠肝脏功能有显著的损伤及坏死，而穴位注射硫普罗宁可显著降低转氨酶，有保护肝脏的作用。
机体脂类代谢失调是诱发脂肪肝的重要因素，通常被认为是形成脂肪肝的第一次打击。TC、TG的测定可直接反映血清中脂质的水平。本实验研究表明：模型组TG、TC高于正常组（P<0.05， P<0.01）；足三里穴位注射组降肝脂、血脂效果优于腹腔注射组（P<0.05）。说明非酒精性脂肪肝与脂质代谢异常密切相关，而足三里穴位注射可以通过有效降低血清TC、TG含量而降低血浆中脂质水平，促进TC、TG代谢达到减轻肝脏脂肪蓄积的目的。
参考文献：
[1] 范建高.非酒精性脂肪性肝病的流行率[J].中国医师进修杂志：内科版，2006，29（9）：1-2.
[2] 邬亚妙.硫普罗宁对非酒精性脂肪性肝病的疗效[J].现代实用医学， 2003，15（9）：582.
[3] 段斐，刘晋芝，孙晓芳，等.大鼠高脂性脂肪肝模型快速制造方法[J].河北职工医学院学报，2003，20（4）：1-2.
[4] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：327-329.
[5] 金建军，徐亚莉，郑昱.穴位注射对非酒精性脂肪肝血脂代谢及肝功能的影响[J].中国针灸，2006，26（2）：100-102.
（收稿日期：2012-02-20，编辑：华强）