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摘 要 以甘蔗高糖品种福农95-1702和低糖品种ROC-5为材料，分析SPS I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ在高、低糖这两个品种的幼叶、第三功能叶和不同蔗茎的表达，测定甘蔗糖分积累早期、中期和后期的糖分含量。结果显示，在功能叶和茎第二节中，三个阶段SPS家族成员在高糖品种的含量整体趋势高于低糖品种，结合蔗糖积累特点分析表明其可能在蔗糖合成中扮演着重要的角色。与正三叶相反，在幼叶中，三个阶段SPS家族成员在高糖品种的表达量整体趋势低于低糖品种，表明其可能与嫩叶的生长等其他生理性状相关，在成熟茎中，随着蔗糖积累时间的增加，高糖品种中的优势表达基因减少，而低糖品种中的优势表达基因增加，这可能与低糖品种中、后期大量积累蔗糖相关。
关键词 甘蔗；蔗糖磷酸合成酶；家族成员；基因表达；实时荧光PCR
中图分类号 Q946；S566.1 文献标识码 A
Abstract Sucrose Phosphate Synthase（SPS）plays a key role for sucrose accumulation in plants. In the study， different tissues from three stages of sucrose accumulation in sugarcane cultivar FN95-1702 with high sugar content and ROC-5 with low sugar content， SPS gene expressions and sugar contents were investigated through RT-q-PCR and HPLC， respectively. The results showed that， in the mature leaves， except SPSⅡ， SPS genes presented significantly higher expression level in the 95-1702 than in ROC-5. Compared to low sugar content cultivar ROC-5， in most of tissues from high sugar content cultivar FN95-1702， SPSI exhibited a higher expression level for the middle stage of sucrose accumulation， SPSⅡ presented more abundant expression for the initial and middle stage of sucrose accumulation， and the expression of SPSⅢ was showed to be stable among the three stage of sucrose accumulation， SPSⅣ was observed to be lower in expression for initial stage of sucrose accumulation， SPSV had a lower expression for initial stage of sucrose accumulation. The results indicated that SPSV， SPSⅡand SPSⅣ contributed to the high sugar content for the initial， middle and final stage， respectively.
Key words Sugarcane； Sucrose phosphate synthase； Gene families； Gene expression； Real-time PCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.018
蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase， SPS， EC 2.4.1.14）是蔗糖合成途径中的关键酶，它催化UDPG（尿嘧啶核苷-5'-二磷酸葡萄糖）和F-6-P（果糖-6-磷酸）生成Su-6-P（蔗糖-6-磷酸）[1]。已有的研究结果表明，植物的SPS活性与蔗糖合成能力紧密相关[2-9]，是蔗糖合成途径中的一个重要控制点。
在植物中，SPS是一个多个基因家族。前期，研究人员将高等植物SPS分为A、B、C 3个家族，这3个家族的成员在单、双子叶植物中广泛分布[10]。随着水稻、玉米等禾本科作物的大规模基因组测序和EST序列测序结果的公布，依据更严格的标准（如全长氨基酸序列、蛋白N端葡糖基转移酶区、蛋白C端SPP相似区以及其酶蛋白结构活性部位的氨基酸序列的相似性），对所有已知的SPS序列进行系统发生分析，在禾本科植物中发现并界定了D家族（包括DⅢ和DⅣ）[11]，研究人员同时在小麦、水稻、玉米等禾本科植物中确定了5个SPS基因家族，分别用罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。其中家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ分别对应于家族C、A、B，其实它们是家族C、A、B的亚家族；而家族Ⅲ、Ⅳ组成了新的D家族，并作为D家族的两个亚家族而存在。以比较基因组和生物信息学为基础，预测甘蔗中存在A、B、C、D共4个家族5个SPS（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）基因[12]。
家族基因的表达特性分析对探讨基因功能有重要意义，不同植物体内SPS分布具有时空特异性，不同类型的基因发挥的功能亦存在差异。在烟草植株中存在A、B、C 3个家族的SPS，叶中主要分布SPSA和SPSC，通过RNAi技术抑制SPSA和SPSC的表达，结果发现在缺乏SPSC的情况下，淀粉不能被有效降解而合成蔗糖，这说明SPSC与淀粉降解后蔗糖的合成密切相关；但抑制SPSA没有明显的效果[13]。在禾本科植物中，研究发现不同家族SPS在不同作物中的分布也有差异。其中小麦、大麦等作物功能叶高表达SPSC，水稻、玉米、甘蔗成熟叶则优势表达SPSB，但它们的确切功能目前仍然未知。鉴于此，2004年，Castleden等[11]应用Northern杂交分析不同生长期的小麦植株体内SPS与SPP转录情况。2007年，Lutfiyya等[14]报道玉米植株体内的7种SPS在不同组织不同生长环境下的转录表达。在甘蔗中，定量PCR检测成熟期叶片和茎中的SPS转录数据表明，D家族基因的SPSⅢ、SPSⅣ在组织中表达量稳定，其中SPSⅢ在不同的茎组织中表达量占SPS转录总量的三成以上，在所分析的茎组织和叶组织中表达量都高于SPSⅣ，这可能预示着SPSⅢ对甘蔗的蔗糖积累起着重要作用[15]。 在糖料作物甘蔗（Saccharum Spp.）中，探讨SPS基因成员表达与糖分积累关系是解析甘蔗糖分积累机制的重要切入点。为此，在Grof C P L等[16]的研究基础上，本研究分析SPS基因家族成员在高低糖甘蔗栽培种的幼叶、第三功能叶和不同蔗茎中的表达特征，测定甘蔗糖分积累早期、中期和后期的糖分含量，以期解析SPS家族成员表达特征与糖分积累关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 甘蔗福农95-1702和ROC-5由农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室育种组提供，均于2009年春季种植于福建农林大学金山校区。在福建福州区域，甘蔗福农95-1702和ROC-5两个品种的糖分积累的早、中、后3个时期分别为10、11和12月。
1.1.2 主要试剂 Trizol购自Invitrogen公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）购自Sigma，PrimeScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）、DNA Marker均购自TaKaRa公司，DNaseⅠ购自Sigma，荧光定量PCR扩增引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其他常规试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 高效液相色谱法分析糖含量 采用Agilent Zorbax carbohydrate柱，以乙腈-水体积比为85 ∶ 15、80 ∶ 20、75 ∶ 25、70 ∶ 30的流动相测定糖混合标准品和甘蔗提取液中各种糖成分的含量和分离情况。具体参照逯平杰等[17]的方法进行。
1.2.2 总RNA的提取及cDNA合成 根据Trizol说明书提取蔗叶和蔗茎的总RNA，并用DNaseⅠ处理RNA中残留DNA。cDNA合成按照Prime ScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）说明书操作。
1.2.3 甘蔗SPS家族基因表达量测定及表达差异分析 根据荧光定量PCR引物设计原则使用Beacon Designer 7设计引物，同时结合参考文献中引物设计[18-19]（引物序列如表1），以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）为内参基因，使用ABI PrismR7300HT Fast Real-Time PCR仪器测定SPS表达量，以福农95-1702未展开幼叶为校准样本，其他均为待测样品，2-△△Ct法分析基因表达水平，比较各家族基因表达差异。
1.3 数据处理
采用Spss17.0软件对相同蔗茎中不同时期含糖量进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 甘蔗福农95-1702和ROC-5糖分积累早期、中期和后期的蔗糖含量分析
通过高效液相色谱法，分别测定了甘蔗福农95-1702和ROC-5糖分积累早、中、后3个时期的4个不同部位茎节组织蔗糖含量，结果见图1。甘蔗福农95-1702在糖分积累各个时期糖分含量都高于ROC-5，福农95-1702在蔗糖积累早期的第2、4、12、18节间中蔗糖含量分别比ROC-5蔗糖含量高189.28%、37.27%、53.98%、70.91%；在蔗糖积累中期的第2、4、12、18节间中蔗糖含量分别比ROC-5蔗糖含量高74.98%、3.72%、5.64%、3.71%，且蔗糖积累中期品种间蔗糖含量的差异明显低于蔗糖积累早期；在蔗糖积累后期的第2、4、12、18节间中蔗糖含量分别比ROC-5蔗糖含量高26.00%、14.48%、10.64%、8.03%，两品种间除茎2中蔗糖含量差距持续减小外，其余节间中蔗糖含量差距均再次扩大。两个甘蔗品种的蔗茎中蔗糖含量都随着糖分积累时间增加而递增。蔗糖积累后期，茎第4、12、18节在两个品种蔗糖含量分别保持基本一致；蔗糖积累中期，茎第12、18节在两个品种蔗糖含量分别无明显差异，而茎4中蔗糖含量则明显低于茎12、茎18。蔗糖积累早期，蔗糖含量除在ROC-5的茎12和茎18中保持一致外，在其余的茎节中蔗糖含量均随着时间的递增而增多，且茎12和茎18中蔗糖含量在ROC-5品种中积累明显低于福农95-1702品种，而在中期ROC-5蔗糖积累迅速增加，蔗糖积累后期增加速度又稍低于福农95-1702品种，但3个时期ROC-5蔗糖含量始终低于福农95-1702品种。
2.2 甘蔗糖分积累初期SPS家族基因的表达差异分析
甘蔗糖分积累初期，比较SPS家族成员在两个品种中的表达特征，结果见图2。SPSⅡ、SPSⅢ和SPSⅣ基因在两个不同品种组织部位相对表达量差异均为极显著（p<0.01），SPSⅠ基因在第18茎节相对表达量差异显著（p<0.05），幼叶和茎在第2节中相对表达量差异极显著（p<0.01），其它组织部位相对表达量差异不显著（p>0.05）。SPSⅤ基因在两个不同品种的蔗茎第9节中相对表达量差异不显著（p>0.05），其它组织部位相对表达量差异极显著（p<0.01）。
2.3 甘蔗糖分积累中期SPS家族基因的表达差异分析
甘蔗糖分积累中期，比较SPS基因成员在两个品种的表达特征，结果见图3，SPSⅠ基因在两个不同品种的甘蔗组织部位中相对表达量差异均为极显著（p<0.01）。SPSⅡ基因在两个不同品种的甘蔗茎第9节、第18节相对表达量无显著差异（p>0.05），其他组织部位均为相对表达量差异极显著（p<0.01）。SPSⅢ基因在两个不同品种的甘蔗幼叶和茎第14节中相对表达量差异显著（p<0.05），其他组织部位均为相对表达量差异极显著（p<0.01）。SPSⅣ基因在两个不同品种的甘蔗茎第9、18节相对表达量差异显著（p<0.05），其他组织部位均为相对表达量差异极显著（p<0.01）。SPSⅤ基因在两个不同品种的甘蔗茎第2、9节相对表达量差异显著（p<0.05），其他组织部位均为相对表达量差异极显著（p<0.01）。 2.4 甘蔗糖分积累后期SPS家族基因的表达差异分析
甘蔗在糖分积累后期，比较SPS基因成员在两个品种的表达特征，结果见图4，SPSⅠ基因在两个不同品种的甘蔗幼叶中、SPSⅡ基因在两个不同品种的蔗茎第9、18节相对表达量差异显著（p<0.05），其它组织部位均为相对表达量差异极显著（p<0.01）。SPSⅢ基因在两个不同品种的甘蔗组织部位中相对表达量差异均为极显著（p<0.01）。SPSⅣ基因在两个不同品种的甘蔗茎第9节、SPSⅤ基因在两个不同品种的甘蔗茎第2、9、18节相对表达量无显著差异（p>0.05），其它组织部位均表现为相对表达量差异极显著（p<0.01）。
2.5 甘蔗糖分积累不同时期SPS家族基因的相对表达量比较
比较SPS家族成员在甘蔗蔗糖积累早、中和后期同一组织部位不同家族成员的差异表达和同一成员在不同组织部位的差异表达，蔗糖积累早期家族基因表达特征如图2和图5所示，在同一组织部位不同家族基因在高、低糖品种甘蔗中的表达特征并不一致，在甘蔗未张开幼叶中，除SPSⅤ外，其他家族基因在低糖品种中优势表达。而在正三叶和茎不同节中SPS家族基因（除SPSⅣ）在高糖品种中的表达整体占优势地位，仅正三叶和茎第9、14节中SPSⅠ的表达在高、低糖品种中无显著差异，茎第14节中SPSⅢ在低糖品种表达量高于高糖品种，茎第9节中SPSⅤ的表达在高、低糖品种间无显著差异；SPSⅣ在不同组织部位的表达均为低糖品种占优势，而SPSⅤ在不同组织部位则基本为高糖品种优势表达，仅茎第9节中高、低糖品种间该基因表达无显著差异，其他SPS家族成员在不同组织部位中的表达未表现出高、低糖品种间表达优势的一致性。
蔗糖积累中期家族基因表达特征如图3和图5所示，在正3叶中，所有家族基因都在高糖品种中相对表达量高于低糖品种，除SPSⅤ在低糖品种茎第2节的表达量高于高糖品种外，其余SPS家族成员在茎第2节表达优势特征与正3叶一致。在高糖品种的相对表达量高于低糖品种的SPS成员分别是甘蔗未张开幼叶中SPSⅢ、SPSⅣ家族基因，茎第9节中的SPSⅠ、SPSⅡ家族基因，茎第14节中的SPSⅠ、SPSⅢ，茎第18节中的SPSⅢ、SPSⅣ家族基因，其余组织部位对应的基因表达特征与之相反，在低糖品种中优势表达；SPSⅠ除茎第18节中的表达在低糖品种高于低糖品种，其余均表现为高糖品种中表达优势，SPSⅤ叶组织中的表达在高糖品种中高于低糖品种，茎组织中与之相反，其它基因在高、低糖品种间不同组织中未表现出表达优势的趋势性。
蔗糖积累后期家族基因表达特征如图4和图5所示，在甘蔗未张开幼叶中，所有家族基因都是在低糖品种中优势表达。正3叶中，仅SPSⅡ基因在低糖品种相对表达量高，其它家族基因均表现为在高糖品种优势表达。在蔗茎第2节，SPSⅠ、SPSⅡ基因在低糖品种的相对表达量高，SPSⅤ基因的相对表达量无显著差异，SPSⅢ、SPSⅣ基因在高糖品种相对表达量高。在蔗茎第9节，SPSⅠ基因在低糖品种的相对表达量高，SPSⅢ基因表达情况则相反，SPSⅡ、SPSⅣ、SPSⅤ基因的表达量在高、低糖品种间无显著差异。在蔗茎第14、18节，仅SPSⅣ基因在高糖品种的相对表达量高，其它家族基因的表达特征均表现为低糖品种占优势；除正3叶中的SPSⅠ在高糖中表达量高，茎第9节中的SPSⅡ在高、低糖品种间表达无显著差异外，SPSⅠ和SPSⅡ在低糖品种中其余组织部位均为优势表达，其它基因在高、低糖品种间不同组织中未表现出表达优势的一致性。
整体而言，在蔗糖积累早期和中期SPS表达量在高糖品种中整体趋势高于低糖品种，而在蔗糖积累后期则表现为相反的趋势。3个时期中幼叶的SPS家族成员总体在低糖品种中高表达，正3叶的SPS家族成员总体在高糖品种中高表达，茎第2节与正3叶表现出高度一致的趋势；其余茎节间无显著的品种间优势表达趋势。
3 讨论与结论
甘蔗的功能叶片是光合作用和蔗糖合成的场所。在功能叶中，3个阶段SPS家族基因表达量整体趋于高糖品种高于低糖品种，尤其在蔗糖积累中期所有SPS家族基因在高糖品种中的表达量均高于低糖品种，这可能与甘蔗功能叶片的蔗糖合成能力直接相关，其中SPSⅢ、SPSⅤ在蔗糖积累的不同时期在高糖品种的表达量均高于低糖品种，说明SPSⅢ、SPSⅤ与高糖品种的高蔗糖性状紧密相关，可能在高糖品种的蔗糖合成中的整个过程中扮演重要的角色。蔗糖积累早期，SPSⅠ和SPSⅣ在高糖品种的表达量显著低于低糖品种，而中、后期则相反，将这一结果结合高、低糖品种不同时期蔗糖含量进行分析，在10～11月份期间低糖品种蔗糖积累速度明显高于高糖品种，而11～12月份期间高糖品种的蔗糖积累速度又反超低糖品种，说明在蔗糖积累早期SPSⅠ和SPSⅣ在低糖品种表达量高的现象可能与随后的低糖品种蔗糖积累迅速相关，而在蔗糖积累后期其在高糖品种表达量高的现象可能与随后的高糖品种蔗糖积累迅速相关。两种情况都表现出SPSⅠ和SPSⅣ的表达量与蔗糖积累的相关性，而蔗糖积累大部分来自叶片中的合成，表明SPSⅠ和SPSⅣ可能在蔗糖合成过程中扮演着至关重要的角色。在糖分积累后期，SPSⅣ、SPSⅤ基因在两个不同品种中均表现为叶组织相对表达量偏高，茎组织相对表达量偏低，进一步证明SPSⅣ和SPSⅤ在甘蔗叶片蔗糖合成中的重要作用。SPSⅡ在蔗糖积累早、中期在高糖品种的表达量显著高于低糖品种，但后期则在低糖品种表达较高，并未表现出与高糖品种和低糖品种蔗糖积累能力的相关性，其可能仅在高糖品种蔗糖积累早、中期扮演重要的角色或者其余蔗糖含量关系无显著相关性，其是否具有其他功能有待进一步研究。
甘蔗的茎组织是糖分贮存的场所。前期的研究结果表明，SPSⅢ在不同的茎组织中表达量占SPS转录总量的三成以上，在所分析的茎组织和叶组织中表达量都高于SPSIV，这可能预示着SPSⅢ对甘蔗的蔗糖积累起着比SPSIV更为重要的作用[16]。本研究中发现茎第2节的SPS家族成员在3个时期不同品种的表达模式与功能叶极为相似，可能由甘蔗嫩茎并非仅仅进行蔗糖积累而且具有蔗糖合成能力的原因导致。而在茎第2节、第9节、12节、18节中，就整体而言，在蔗糖积累早期所有组织部位中，在高糖品种表达量高的基因有12个，低糖品种中优势表达的基因有5个；在蔗糖积累中期所有组织部位中，高糖品种中表达优势的基因有10个，低糖品种中优势表达的基因有10个；在蔗糖积累后期所有组织部位中，高糖品种中表达优势的基因有5个，低糖品种中优势表达的基因有10个。随着蔗糖积累时间的增加，高糖品种中的优势基因减少，而低糖品种中的优势基因增加，这可能与低糖品种中后期大量积累蔗糖相关。结果说明，蔗糖磷酸合成酶对不同品种中蔗糖积累起着重要的作用，与前人的研究结果基本一致[20-24]。而前人对于SPSⅢ在蔗糖积累中的重要功能预测，本研究没有验证结果。 本研究通过分析蔗糖磷酸合成酶基因各家族成员在高糖、低糖甘蔗生长的特定时期，不同部位的表达情况，分析蔗糖磷酸合成酶基因各家族成员在甘蔗生长过程中对糖分积累的影响，为研究SPS家族基因各成员在高糖、低糖甘蔗生长过程中对糖分积累的影响打下坚实基础。下一步的研究，将对SPS家族基因及其启动子进行克隆和功能研究，为深入研究蔗糖磷酸合成酶与糖代谢的关系提供更明确的方向。
参考文献
[1] Jonathan I， John W C， Lisa G， et al. Analysis of cDNA Clones Encoding Sucrose-Phosphate Synthase in Relation to Sugar Interconversions Associated with Dehydration in the Resurrection Plant Craterostigma plantagineum Hochst[J]. Plant Physiol， 1997， 115： 113-121.
[2] Huber S. Interspecific variation in activity and regulation of leaf sucrose phosphate synthetase[J]. Z Pflanzenphysiol， 1981， 102： 443-450.
[3] Douglas C Doehlert， Steven C Huber. The role of sulfhydryl groups in the regulation of spinach leaf sucrose phosphate synthase[J]. Elsevier， 1985， 830（3）： 267-273.
[4] Huber S. Role of sucrose-phosphate synthase in partitioning of carbon in leaves[J]. Plant physiology， 1983， 71（4）： 818.
[5] Worrell A C， Bruneau J M， Summerfelt K， et al. Expression of a maize sucrose phosphate synthase in tomato alters leaf carbohydrate partitioning[J]. Plant Cell， 1991， 3（10）： 1 121-1 130.
[6] Geigenberger P， Reimholz R， Deiting U， et al. Decreased expression of sucrose phosphate synthase strongly inhibits the water stress-induced synthesis of sucrose in growing potato tubers[J]. Plant J， 1999， 19（2）： 119-129.
[7] Kaur K， Gupta A K， Kaur N. Effect of water deficit on carbohydrate status and enzymes of carbohydrate metabolism in seedlings of wheat cultivars[J]. Indian J Biochem Biophys， 2007， 44（4）： 223-230.
[8] Basu PS， Ali M， Chaturvedi S K. Osmotic adjustment increases water uptake， remobilization of assimilates and maintains photosynthesis in chickpea under drought[J]. Indian J Exp Biol， 2007， 45（3）： 261-267.
[9] Whittaker A， Martinelli T， Farrant J M， et al. Sucrose phosphate synthase activity and the co-ordination of carbon partitioning during sucrose and amino acid accumulation in desiccation-tolerant leaf material of the C4 resurrection plant Sporobolus stapfianus during dehydration[J]. J Exp Bot， 2007， 58（13）： 3 775-3 787.
[10] Langenkamper G， Fung R W， Newcomb R D， et al. Sucrose phosphate synthase genes in plants belong to three different families[J]. J Mol Evol， 2002， 54（3）： 322-332.
[11] Castleden C K， Aoki N， Gillespie V J， et al. Evolution and function of the sucrose-phosphate synthase gene families in wheat and other grasses[J]. Plant Physiol， 2004， 135（3）： 1 753-1 764. [12] Lutfiyya LL， Xu N， D'Ordine R L， et al. Phylogenetic and expression analysis of sucrose phosphate synthase isozymes in plants[J]. J Plant Physiol， 2007， 164（7）： 923-933.
[13] Castleden C， Aoki N， Gillespie V， et al. Evolution and function of the sucrose-phosphate synthase gene families in wheat and other grasses[J]. Plant physiology， 2004， 135（3）： 1 753.
[14] Chen S， Hajirezaei M， Bornke F. Differential expression of sucrose-phosphate synthase isoenzymes in tobacco reflects their functional specialization during dark-governed starch mobilization in source leaves[J]. Plant Physiol， 2005， 139（3）： 1 163-1 174.
[15] Grof C P L， So C T E， Perroux J M， et al. The five families of sucrose-phosphate synthase genes in Saccharum spp. are differentially expressed in leaves and stem[J]. Funct Plant Biol， 2006， 33： 605-610.
[16] 逯平杰， 代容春， 叶冰莹， 等. 高效液相色谱法测定甘蔗节间果糖、葡萄糖和蔗糖的含量[J]. 食品科学， 2011， 32（02）： 198-200.
[17] 张积森， 陈由强， 郭春芳， 等. 甘蔗水分胁迫响应的δ-鸟氨酸转氨酶基因克隆及分子特征分析[J]. 热带作物学报， 2009， 30（8）： 1 062-1 068.
[18] Grof C P L， So C T E， Perroux J M， et al. The five families of sucrose-phosphate synthase genes in Saccharum spp. are differentially expressed in leaves and stem[J]. Functional Plant Biology， 2006， 33： 605-610.
[19] Kenneth J Livak， Thomas D. Schmittgen， 1 Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-△△Ct Method[J]. Methods， 2001， 25： 402-408.
[20] Botha F C， Black K G. Sucrose phosphate synthase and sucrose synthase activity during maturation of internodal tissue in sugarcane[J]. Australian Journal of Plant Physiology， 2000， 27（1）： 81-85.
[21] Terauchi T， Atsuoka M， Obayashi M， et al. Activity of Sucrose Phosphate Synthase in Relation to Sucrose Concentration in Sugarcane Internodes[J]. Japanese Journal of Tropical Agriculture， 2000， 44（3）： 147-151.
[22] Guti rrez-Miceli F A， Rodr guez-Mendiola M A， Ochoa-Alejo， et al. Sucrose accumulation and enzyme activities in callus culture of sugarcane[J]. Biologia Plantarum， 2005， 49（3）： 475-479.
[23] Grof C P L， Albertson P L， Bursle J， et al. Sucrose-Phosphate Synthase， a Biochemical Marker of High Sucrose Accumulation in Sugarcane[J]. Crop Sci， 2007， 47： 1 530-1 539.
[24] Zhu Y J， Komor E， Moore P H. Sucrose accumulation in the sugarcane stem is regulated by the difference between the activities of soluble acid invertase and sucrose phosphate synthase[J]. Plant Physiol， 1997， 115： 609-616.
关键词 甘蔗；蔗糖磷酸合成酶；家族成员；基因表达；实时荧光PCR
中图分类号 Q946；S566.1 文献标识码 A
Abstract Sucrose Phosphate Synthase（SPS）plays a key role for sucrose accumulation in plants. In the study， different tissues from three stages of sucrose accumulation in sugarcane cultivar FN95-1702 with high sugar content and ROC-5 with low sugar content， SPS gene expressions and sugar contents were investigated through RT-q-PCR and HPLC， respectively. The results showed that， in the mature leaves， except SPSⅡ， SPS genes presented significantly higher expression level in the 95-1702 than in ROC-5. Compared to low sugar content cultivar ROC-5， in most of tissues from high sugar content cultivar FN95-1702， SPSI exhibited a higher expression level for the middle stage of sucrose accumulation， SPSⅡ presented more abundant expression for the initial and middle stage of sucrose accumulation， and the expression of SPSⅢ was showed to be stable among the three stage of sucrose accumulation， SPSⅣ was observed to be lower in expression for initial stage of sucrose accumulation， SPSV had a lower expression for initial stage of sucrose accumulation. The results indicated that SPSV， SPSⅡand SPSⅣ contributed to the high sugar content for the initial， middle and final stage， respectively.
Key words Sugarcane； Sucrose phosphate synthase； Gene families； Gene expression； Real-time PCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.018
蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase， SPS， EC 2.4.1.14）是蔗糖合成途径中的关键酶，它催化UDPG（尿嘧啶核苷-5'-二磷酸葡萄糖）和F-6-P（果糖-6-磷酸）生成Su-6-P（蔗糖-6-磷酸）[1]。已有的研究结果表明，植物的SPS活性与蔗糖合成能力紧密相关[2-9]，是蔗糖合成途径中的一个重要控制点。
在植物中，SPS是一个多个基因家族。前期，研究人员将高等植物SPS分为A、B、C 3个家族，这3个家族的成员在单、双子叶植物中广泛分布[10]。随着水稻、玉米等禾本科作物的大规模基因组测序和EST序列测序结果的公布，依据更严格的标准（如全长氨基酸序列、蛋白N端葡糖基转移酶区、蛋白C端SPP相似区以及其酶蛋白结构活性部位的氨基酸序列的相似性），对所有已知的SPS序列进行系统发生分析，在禾本科植物中发现并界定了D家族（包括DⅢ和DⅣ）[11]，研究人员同时在小麦、水稻、玉米等禾本科植物中确定了5个SPS基因家族，分别用罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。其中家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ分别对应于家族C、A、B，其实它们是家族C、A、B的亚家族；而家族Ⅲ、Ⅳ组成了新的D家族，并作为D家族的两个亚家族而存在。以比较基因组和生物信息学为基础，预测甘蔗中存在A、B、C、D共4个家族5个SPS（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）基因[12]。
家族基因的表达特性分析对探讨基因功能有重要意义，不同植物体内SPS分布具有时空特异性，不同类型的基因发挥的功能亦存在差异。在烟草植株中存在A、B、C 3个家族的SPS，叶中主要分布SPSA和SPSC，通过RNAi技术抑制SPSA和SPSC的表达，结果发现在缺乏SPSC的情况下，淀粉不能被有效降解而合成蔗糖，这说明SPSC与淀粉降解后蔗糖的合成密切相关；但抑制SPSA没有明显的效果[13]。在禾本科植物中，研究发现不同家族SPS在不同作物中的分布也有差异。其中小麦、大麦等作物功能叶高表达SPSC，水稻、玉米、甘蔗成熟叶则优势表达SPSB，但它们的确切功能目前仍然未知。鉴于此，2004年，Castleden等[11]应用Northern杂交分析不同生长期的小麦植株体内SPS与SPP转录情况。2007年，Lutfiyya等[14]报道玉米植株体内的7种SPS在不同组织不同生长环境下的转录表达。在甘蔗中，定量PCR检测成熟期叶片和茎中的SPS转录数据表明，D家族基因的SPSⅢ、SPSⅣ在组织中表达量稳定，其中SPSⅢ在不同的茎组织中表达量占SPS转录总量的三成以上，在所分析的茎组织和叶组织中表达量都高于SPSⅣ，这可能预示着SPSⅢ对甘蔗的蔗糖积累起着重要作用[15]。 在糖料作物甘蔗（Saccharum Spp.）中，探讨SPS基因成员表达与糖分积累关系是解析甘蔗糖分积累机制的重要切入点。为此，在Grof C P L等[16]的研究基础上，本研究分析SPS基因家族成员在高低糖甘蔗栽培种的幼叶、第三功能叶和不同蔗茎中的表达特征，测定甘蔗糖分积累早期、中期和后期的糖分含量，以期解析SPS家族成员表达特征与糖分积累关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 甘蔗福农95-1702和ROC-5由农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室育种组提供，均于2009年春季种植于福建农林大学金山校区。在福建福州区域，甘蔗福农95-1702和ROC-5两个品种的糖分积累的早、中、后3个时期分别为10、11和12月。
1.1.2 主要试剂 Trizol购自Invitrogen公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）购自Sigma，PrimeScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）、DNA Marker均购自TaKaRa公司，DNaseⅠ购自Sigma，荧光定量PCR扩增引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其他常规试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 高效液相色谱法分析糖含量 采用Agilent Zorbax carbohydrate柱，以乙腈-水体积比为85 ∶ 15、80 ∶ 20、75 ∶ 25、70 ∶ 30的流动相测定糖混合标准品和甘蔗提取液中各种糖成分的含量和分离情况。具体参照逯平杰等[17]的方法进行。
1.2.2 总RNA的提取及cDNA合成 根据Trizol说明书提取蔗叶和蔗茎的总RNA，并用DNaseⅠ处理RNA中残留DNA。cDNA合成按照Prime ScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）说明书操作。
1.2.3 甘蔗SPS家族基因表达量测定及表达差异分析 根据荧光定量PCR引物设计原则使用Beacon Designer 7设计引物，同时结合参考文献中引物设计[18-19]（引物序列如表1），以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）为内参基因，使用ABI PrismR7300HT Fast Real-Time PCR仪器测定SPS表达量，以福农95-1702未展开幼叶为校准样本，其他均为待测样品，2-△△Ct法分析基因表达水平，比较各家族基因表达差异。
1.3 数据处理
采用Spss17.0软件对相同蔗茎中不同时期含糖量进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 甘蔗福农95-1702和ROC-5糖分积累早期、中期和后期的蔗糖含量分析
通过高效液相色谱法，分别测定了甘蔗福农95-1702和ROC-5糖分积累早、中、后3个时期的4个不同部位茎节组织蔗糖含量，结果见图1。甘蔗福农95-1702在糖分积累各个时期糖分含量都高于ROC-5，福农95-1702在蔗糖积累早期的第2、4、12、18节间中蔗糖含量分别比ROC-5蔗糖含量高189.28%、37.27%、53.98%、70.91%；在蔗糖积累中期的第2、4、12、18节间中蔗糖含量分别比ROC-5蔗糖含量高74.98%、3.72%、5.64%、3.71%，且蔗糖积累中期品种间蔗糖含量的差异明显低于蔗糖积累早期；在蔗糖积累后期的第2、4、12、18节间中蔗糖含量分别比ROC-5蔗糖含量高26.00%、14.48%、10.64%、8.03%，两品种间除茎2中蔗糖含量差距持续减小外，其余节间中蔗糖含量差距均再次扩大。两个甘蔗品种的蔗茎中蔗糖含量都随着糖分积累时间增加而递增。蔗糖积累后期，茎第4、12、18节在两个品种蔗糖含量分别保持基本一致；蔗糖积累中期，茎第12、18节在两个品种蔗糖含量分别无明显差异，而茎4中蔗糖含量则明显低于茎12、茎18。蔗糖积累早期，蔗糖含量除在ROC-5的茎12和茎18中保持一致外，在其余的茎节中蔗糖含量均随着时间的递增而增多，且茎12和茎18中蔗糖含量在ROC-5品种中积累明显低于福农95-1702品种，而在中期ROC-5蔗糖积累迅速增加，蔗糖积累后期增加速度又稍低于福农95-1702品种，但3个时期ROC-5蔗糖含量始终低于福农95-1702品种。
2.2 甘蔗糖分积累初期SPS家族基因的表达差异分析
甘蔗糖分积累初期，比较SPS家族成员在两个品种中的表达特征，结果见图2。SPSⅡ、SPSⅢ和SPSⅣ基因在两个不同品种组织部位相对表达量差异均为极显著（p<0.01），SPSⅠ基因在第18茎节相对表达量差异显著（p<0.05），幼叶和茎在第2节中相对表达量差异极显著（p<0.01），其它组织部位相对表达量差异不显著（p>0.05）。SPSⅤ基因在两个不同品种的蔗茎第9节中相对表达量差异不显著（p>0.05），其它组织部位相对表达量差异极显著（p<0.01）。
2.3 甘蔗糖分积累中期SPS家族基因的表达差异分析
甘蔗糖分积累中期，比较SPS基因成员在两个品种的表达特征，结果见图3，SPSⅠ基因在两个不同品种的甘蔗组织部位中相对表达量差异均为极显著（p<0.01）。SPSⅡ基因在两个不同品种的甘蔗茎第9节、第18节相对表达量无显著差异（p>0.05），其他组织部位均为相对表达量差异极显著（p<0.01）。SPSⅢ基因在两个不同品种的甘蔗幼叶和茎第14节中相对表达量差异显著（p<0.05），其他组织部位均为相对表达量差异极显著（p<0.01）。SPSⅣ基因在两个不同品种的甘蔗茎第9、18节相对表达量差异显著（p<0.05），其他组织部位均为相对表达量差异极显著（p<0.01）。SPSⅤ基因在两个不同品种的甘蔗茎第2、9节相对表达量差异显著（p<0.05），其他组织部位均为相对表达量差异极显著（p<0.01）。 2.4 甘蔗糖分积累后期SPS家族基因的表达差异分析
甘蔗在糖分积累后期，比较SPS基因成员在两个品种的表达特征，结果见图4，SPSⅠ基因在两个不同品种的甘蔗幼叶中、SPSⅡ基因在两个不同品种的蔗茎第9、18节相对表达量差异显著（p<0.05），其它组织部位均为相对表达量差异极显著（p<0.01）。SPSⅢ基因在两个不同品种的甘蔗组织部位中相对表达量差异均为极显著（p<0.01）。SPSⅣ基因在两个不同品种的甘蔗茎第9节、SPSⅤ基因在两个不同品种的甘蔗茎第2、9、18节相对表达量无显著差异（p>0.05），其它组织部位均表现为相对表达量差异极显著（p<0.01）。
2.5 甘蔗糖分积累不同时期SPS家族基因的相对表达量比较
比较SPS家族成员在甘蔗蔗糖积累早、中和后期同一组织部位不同家族成员的差异表达和同一成员在不同组织部位的差异表达，蔗糖积累早期家族基因表达特征如图2和图5所示，在同一组织部位不同家族基因在高、低糖品种甘蔗中的表达特征并不一致，在甘蔗未张开幼叶中，除SPSⅤ外，其他家族基因在低糖品种中优势表达。而在正三叶和茎不同节中SPS家族基因（除SPSⅣ）在高糖品种中的表达整体占优势地位，仅正三叶和茎第9、14节中SPSⅠ的表达在高、低糖品种中无显著差异，茎第14节中SPSⅢ在低糖品种表达量高于高糖品种，茎第9节中SPSⅤ的表达在高、低糖品种间无显著差异；SPSⅣ在不同组织部位的表达均为低糖品种占优势，而SPSⅤ在不同组织部位则基本为高糖品种优势表达，仅茎第9节中高、低糖品种间该基因表达无显著差异，其他SPS家族成员在不同组织部位中的表达未表现出高、低糖品种间表达优势的一致性。
蔗糖积累中期家族基因表达特征如图3和图5所示，在正3叶中，所有家族基因都在高糖品种中相对表达量高于低糖品种，除SPSⅤ在低糖品种茎第2节的表达量高于高糖品种外，其余SPS家族成员在茎第2节表达优势特征与正3叶一致。在高糖品种的相对表达量高于低糖品种的SPS成员分别是甘蔗未张开幼叶中SPSⅢ、SPSⅣ家族基因，茎第9节中的SPSⅠ、SPSⅡ家族基因，茎第14节中的SPSⅠ、SPSⅢ，茎第18节中的SPSⅢ、SPSⅣ家族基因，其余组织部位对应的基因表达特征与之相反，在低糖品种中优势表达；SPSⅠ除茎第18节中的表达在低糖品种高于低糖品种，其余均表现为高糖品种中表达优势，SPSⅤ叶组织中的表达在高糖品种中高于低糖品种，茎组织中与之相反，其它基因在高、低糖品种间不同组织中未表现出表达优势的趋势性。
蔗糖积累后期家族基因表达特征如图4和图5所示，在甘蔗未张开幼叶中，所有家族基因都是在低糖品种中优势表达。正3叶中，仅SPSⅡ基因在低糖品种相对表达量高，其它家族基因均表现为在高糖品种优势表达。在蔗茎第2节，SPSⅠ、SPSⅡ基因在低糖品种的相对表达量高，SPSⅤ基因的相对表达量无显著差异，SPSⅢ、SPSⅣ基因在高糖品种相对表达量高。在蔗茎第9节，SPSⅠ基因在低糖品种的相对表达量高，SPSⅢ基因表达情况则相反，SPSⅡ、SPSⅣ、SPSⅤ基因的表达量在高、低糖品种间无显著差异。在蔗茎第14、18节，仅SPSⅣ基因在高糖品种的相对表达量高，其它家族基因的表达特征均表现为低糖品种占优势；除正3叶中的SPSⅠ在高糖中表达量高，茎第9节中的SPSⅡ在高、低糖品种间表达无显著差异外，SPSⅠ和SPSⅡ在低糖品种中其余组织部位均为优势表达，其它基因在高、低糖品种间不同组织中未表现出表达优势的一致性。
整体而言，在蔗糖积累早期和中期SPS表达量在高糖品种中整体趋势高于低糖品种，而在蔗糖积累后期则表现为相反的趋势。3个时期中幼叶的SPS家族成员总体在低糖品种中高表达，正3叶的SPS家族成员总体在高糖品种中高表达，茎第2节与正3叶表现出高度一致的趋势；其余茎节间无显著的品种间优势表达趋势。
3 讨论与结论
甘蔗的功能叶片是光合作用和蔗糖合成的场所。在功能叶中，3个阶段SPS家族基因表达量整体趋于高糖品种高于低糖品种，尤其在蔗糖积累中期所有SPS家族基因在高糖品种中的表达量均高于低糖品种，这可能与甘蔗功能叶片的蔗糖合成能力直接相关，其中SPSⅢ、SPSⅤ在蔗糖积累的不同时期在高糖品种的表达量均高于低糖品种，说明SPSⅢ、SPSⅤ与高糖品种的高蔗糖性状紧密相关，可能在高糖品种的蔗糖合成中的整个过程中扮演重要的角色。蔗糖积累早期，SPSⅠ和SPSⅣ在高糖品种的表达量显著低于低糖品种，而中、后期则相反，将这一结果结合高、低糖品种不同时期蔗糖含量进行分析，在10～11月份期间低糖品种蔗糖积累速度明显高于高糖品种，而11～12月份期间高糖品种的蔗糖积累速度又反超低糖品种，说明在蔗糖积累早期SPSⅠ和SPSⅣ在低糖品种表达量高的现象可能与随后的低糖品种蔗糖积累迅速相关，而在蔗糖积累后期其在高糖品种表达量高的现象可能与随后的高糖品种蔗糖积累迅速相关。两种情况都表现出SPSⅠ和SPSⅣ的表达量与蔗糖积累的相关性，而蔗糖积累大部分来自叶片中的合成，表明SPSⅠ和SPSⅣ可能在蔗糖合成过程中扮演着至关重要的角色。在糖分积累后期，SPSⅣ、SPSⅤ基因在两个不同品种中均表现为叶组织相对表达量偏高，茎组织相对表达量偏低，进一步证明SPSⅣ和SPSⅤ在甘蔗叶片蔗糖合成中的重要作用。SPSⅡ在蔗糖积累早、中期在高糖品种的表达量显著高于低糖品种，但后期则在低糖品种表达较高，并未表现出与高糖品种和低糖品种蔗糖积累能力的相关性，其可能仅在高糖品种蔗糖积累早、中期扮演重要的角色或者其余蔗糖含量关系无显著相关性，其是否具有其他功能有待进一步研究。
甘蔗的茎组织是糖分贮存的场所。前期的研究结果表明，SPSⅢ在不同的茎组织中表达量占SPS转录总量的三成以上，在所分析的茎组织和叶组织中表达量都高于SPSIV，这可能预示着SPSⅢ对甘蔗的蔗糖积累起着比SPSIV更为重要的作用[16]。本研究中发现茎第2节的SPS家族成员在3个时期不同品种的表达模式与功能叶极为相似，可能由甘蔗嫩茎并非仅仅进行蔗糖积累而且具有蔗糖合成能力的原因导致。而在茎第2节、第9节、12节、18节中，就整体而言，在蔗糖积累早期所有组织部位中，在高糖品种表达量高的基因有12个，低糖品种中优势表达的基因有5个；在蔗糖积累中期所有组织部位中，高糖品种中表达优势的基因有10个，低糖品种中优势表达的基因有10个；在蔗糖积累后期所有组织部位中，高糖品种中表达优势的基因有5个，低糖品种中优势表达的基因有10个。随着蔗糖积累时间的增加，高糖品种中的优势基因减少，而低糖品种中的优势基因增加，这可能与低糖品种中后期大量积累蔗糖相关。结果说明，蔗糖磷酸合成酶对不同品种中蔗糖积累起着重要的作用，与前人的研究结果基本一致[20-24]。而前人对于SPSⅢ在蔗糖积累中的重要功能预测，本研究没有验证结果。 本研究通过分析蔗糖磷酸合成酶基因各家族成员在高糖、低糖甘蔗生长的特定时期，不同部位的表达情况，分析蔗糖磷酸合成酶基因各家族成员在甘蔗生长过程中对糖分积累的影响，为研究SPS家族基因各成员在高糖、低糖甘蔗生长过程中对糖分积累的影响打下坚实基础。下一步的研究，将对SPS家族基因及其启动子进行克隆和功能研究，为深入研究蔗糖磷酸合成酶与糖代谢的关系提供更明确的方向。
参考文献
[1] Jonathan I， John W C， Lisa G， et al. Analysis of cDNA Clones Encoding Sucrose-Phosphate Synthase in Relation to Sugar Interconversions Associated with Dehydration in the Resurrection Plant Craterostigma plantagineum Hochst[J]. Plant Physiol， 1997， 115： 113-121.
[2] Huber S. Interspecific variation in activity and regulation of leaf sucrose phosphate synthetase[J]. Z Pflanzenphysiol， 1981， 102： 443-450.
[3] Douglas C Doehlert， Steven C Huber. The role of sulfhydryl groups in the regulation of spinach leaf sucrose phosphate synthase[J]. Elsevier， 1985， 830（3）： 267-273.
[4] Huber S. Role of sucrose-phosphate synthase in partitioning of carbon in leaves[J]. Plant physiology， 1983， 71（4）： 818.
[5] Worrell A C， Bruneau J M， Summerfelt K， et al. Expression of a maize sucrose phosphate synthase in tomato alters leaf carbohydrate partitioning[J]. Plant Cell， 1991， 3（10）： 1 121-1 130.
[6] Geigenberger P， Reimholz R， Deiting U， et al. Decreased expression of sucrose phosphate synthase strongly inhibits the water stress-induced synthesis of sucrose in growing potato tubers[J]. Plant J， 1999， 19（2）： 119-129.
[7] Kaur K， Gupta A K， Kaur N. Effect of water deficit on carbohydrate status and enzymes of carbohydrate metabolism in seedlings of wheat cultivars[J]. Indian J Biochem Biophys， 2007， 44（4）： 223-230.
[8] Basu PS， Ali M， Chaturvedi S K. Osmotic adjustment increases water uptake， remobilization of assimilates and maintains photosynthesis in chickpea under drought[J]. Indian J Exp Biol， 2007， 45（3）： 261-267.
[9] Whittaker A， Martinelli T， Farrant J M， et al. Sucrose phosphate synthase activity and the co-ordination of carbon partitioning during sucrose and amino acid accumulation in desiccation-tolerant leaf material of the C4 resurrection plant Sporobolus stapfianus during dehydration[J]. J Exp Bot， 2007， 58（13）： 3 775-3 787.
[10] Langenkamper G， Fung R W， Newcomb R D， et al. Sucrose phosphate synthase genes in plants belong to three different families[J]. J Mol Evol， 2002， 54（3）： 322-332.
[11] Castleden C K， Aoki N， Gillespie V J， et al. Evolution and function of the sucrose-phosphate synthase gene families in wheat and other grasses[J]. Plant Physiol， 2004， 135（3）： 1 753-1 764. [12] Lutfiyya LL， Xu N， D'Ordine R L， et al. Phylogenetic and expression analysis of sucrose phosphate synthase isozymes in plants[J]. J Plant Physiol， 2007， 164（7）： 923-933.
[13] Castleden C， Aoki N， Gillespie V， et al. Evolution and function of the sucrose-phosphate synthase gene families in wheat and other grasses[J]. Plant physiology， 2004， 135（3）： 1 753.
[14] Chen S， Hajirezaei M， Bornke F. Differential expression of sucrose-phosphate synthase isoenzymes in tobacco reflects their functional specialization during dark-governed starch mobilization in source leaves[J]. Plant Physiol， 2005， 139（3）： 1 163-1 174.
[15] Grof C P L， So C T E， Perroux J M， et al. The five families of sucrose-phosphate synthase genes in Saccharum spp. are differentially expressed in leaves and stem[J]. Funct Plant Biol， 2006， 33： 605-610.
[16] 逯平杰， 代容春， 叶冰莹， 等. 高效液相色谱法测定甘蔗节间果糖、葡萄糖和蔗糖的含量[J]. 食品科学， 2011， 32（02）： 198-200.
[17] 张积森， 陈由强， 郭春芳， 等. 甘蔗水分胁迫响应的δ-鸟氨酸转氨酶基因克隆及分子特征分析[J]. 热带作物学报， 2009， 30（8）： 1 062-1 068.
[18] Grof C P L， So C T E， Perroux J M， et al. The five families of sucrose-phosphate synthase genes in Saccharum spp. are differentially expressed in leaves and stem[J]. Functional Plant Biology， 2006， 33： 605-610.
[19] Kenneth J Livak， Thomas D. Schmittgen， 1 Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-△△Ct Method[J]. Methods， 2001， 25： 402-408.
[20] Botha F C， Black K G. Sucrose phosphate synthase and sucrose synthase activity during maturation of internodal tissue in sugarcane[J]. Australian Journal of Plant Physiology， 2000， 27（1）： 81-85.
[21] Terauchi T， Atsuoka M， Obayashi M， et al. Activity of Sucrose Phosphate Synthase in Relation to Sucrose Concentration in Sugarcane Internodes[J]. Japanese Journal of Tropical Agriculture， 2000， 44（3）： 147-151.
[22] Guti rrez-Miceli F A， Rodr guez-Mendiola M A， Ochoa-Alejo， et al. Sucrose accumulation and enzyme activities in callus culture of sugarcane[J]. Biologia Plantarum， 2005， 49（3）： 475-479.
[23] Grof C P L， Albertson P L， Bursle J， et al. Sucrose-Phosphate Synthase， a Biochemical Marker of High Sucrose Accumulation in Sugarcane[J]. Crop Sci， 2007， 47： 1 530-1 539.
[24] Zhu Y J， Komor E， Moore P H. Sucrose accumulation in the sugarcane stem is regulated by the difference between the activities of soluble acid invertase and sucrose phosphate synthase[J]. Plant Physiol， 1997， 115： 609-616.