论文部分内容阅读
【摘要】 目的：探讨β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马组织及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。方法：经过敞箱实验选取得分相近的2～3个月龄SD大鼠80只，按随机数字表法分为四组，每组20只，结合孤养并给予慢性轻度不可预见刺激，复制抑郁模型，于造模成功第2天开始，分别给予氟西汀组和β-细辛醚组1.2 mg/（kg·d）氟西汀和25 mg/（kg·d）β-细辛醚灌胃，模型组与正常组给予等体积生理盐水。于第21天对大鼠处死取脑，免疫组织化学法检测Bax、Bcl-2蛋白相对含量。结果：模型组大鼠海马组织神经元数目减少，散在排列，细胞核发生固缩变形，CA1区，CA3区变化显著。与模型组比较，β-细辛醚组、氟西汀组Bax蛋白表达均显著降低（P<0.01）。结论：β-细辛醚可以降低大鼠海马组织Bax蛋白表达，促进Bcl-2蛋白表达。
【关键词】 β-细辛醚； 海马； B细胞淋巴瘤/白血病-2； Bax
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of β-assrone on the hippocampus and the expressions of protein Bax and Bcl-2 in the hippocampus of depression model rats.Method：According to the open field test，adult Sprague-Dawley rates with similar scores were randomly divided into 4 groups， each group had 20 cases. Solitary and chronic mild unpredictability stimulation on each one except the normal control group， copy the model of depression. On the second day of a successful model replication， the fluoxetine control group and the β-asarone group were given 1.2 mg/（kg·d） the fluoxetine and 25 mg/（kg·d） the β-asarone. The model control group and the normal control group were given equal volumes of normal saline. On the 21th day， rats were to be put to death and take brain tissue. The protein expression of Bax and Bcl-2 in the hippocampus were tested by immunohistochemical staining method.Result：The numbers of neurons were reduced in the hippocampus of model group， scattered in the arrangement， the nucleus of neurons were pycnosis deformation，especially on the region of CA1 and CA3. Compared with model group， the protein expression of Bax reduced and Bcl-2 increased with statistical significance in the hippocampus in fluoxetine control group and β-asarone group（P<0.01）.Conclusion：β-asarone can reduce the protein expression of Bax， while promote the protein expression of Bcl-2 in the hippocampus of depression model rats.
【Key words】 β-asarone； Hippocampus； B celll ymphoma/leukemis-2； Bcl-2 associated X protein
First-author’s address：Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.012
抑郁症（depression）是临床较为常见的精神疾病性障碍，病因较为复杂，病程较长，发病率呈逐年上升趋势[1-2]。中药石菖蒲具有提神醒脑、开窍益智的作用，是中医治疗脑病常用药物之一，现代药理学研究提示，石菖蒲具有较好的抗抑郁作用[3]。本实验通过研究石菖蒲主要有效成分β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马区的作用，探讨其对海马神经元凋亡因子Bax（Bcl-2 associated X protein，Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemis-2，Bcl-2）表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 2～3个月龄的清洁级雄性SD大鼠，体重180～200 g，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（辽）2008-0002。
1.1.2 药品 盐酸氟西汀胶囊（由苏州俞氏药业有限公司提供），β-细辛醚标准品（由天津一方科技有限公司提供）。 1.1.3 其他材料 试剂兔抗鼠Bax抗体（购于Abcam公司）、兔抗鼠Bcl-2抗体（购于Abcam公司）。免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂、PBS缓冲液（购于福州迈新生物技术开发有限公司）。
1.1.4 仪器 光学显微镜CX11R BSF（Olympus），图像分析系统DP801（Alphamiager公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 大鼠适应性喂养1周，自由进食水。保持环境干燥，通风，温度18～20 ℃，无噪声，无人为光源。进行敞箱实验（Open-field-test），选取得分相近的80只大鼠进行分组，按随机数字表法分为四组：正常组、β-细辛醚组、氟西汀组、模型组，每组20只。
1.2.2 具体方法 除正常组外每笼单只饲养，正常组不给予任何刺激。β-细辛醚组、氟西汀组、模型组，均接受慢性轻度不可预见性应激刺激（Chronic unpredictable mild stress stimulation，CUMS）：每天进行一种不可预知的刺激，持续21 d，每种刺激使用不超过4次，避免大鼠适应刺激，刺激方法根据Katz法改进。具体方法：摇晃（30 min），倾斜鼠笼（45°，24 h），禁食水（24 h），束缚（24 h），热刺激（45 ℃，5 min），冰水游泳（4 ℃，5 min），夹尾（3 min），潮湿环境（100 g垫料中加入200 mL水，24 h）。造模开始计为第1天。第2天起，β-细辛醚组给予10 g/L的β-细辛醚组混悬液，按25 mg/（kg·d）灌胃给药。氟西汀组给予10 g/L的氟西汀混悬液，按1.2 mg/（kg·d）灌胃给药。模型组给予等量生理盐水，每天灌胃一次。
1.2.3 免疫组织化学法检测大鼠海马组织Bax、Bcl-2蛋白表达 石蜡切片脱蜡和水化后进行抗原修复。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶（SP）法进行免疫组织化学染色，并DAB显色，经过苏木素复染、PBS洗涤、盐酸乙醇分化后返蓝，常规脱水、透明、中性树胶封片。每一张切片在阳性表达区域挑选10个无重叠视野，使用Olympus显微镜、DP801形态分析软件进行图像采集处理，图像分析系统进行分析，测出Bax、Bcl-2蛋白抗原表达的总面积、阳性细胞数和平均吸光度IA，计算其积分吸光度。
1.3 统计学处理 运用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理，计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠海马区Bax蛋白表达 模型组大鼠海马区Bax蛋白表达较正常组显著增强，两组积分光密度比较差异有统计学意义（P<0.05），β-细辛醚组、氟西汀组与模型组比较积分光密度明显降低（P<0.05），见图1、表1。
2.2 各组大鼠海马区Bcl-2蛋白表达 模型组的Bcl-2蛋白表达明显低于正常组，积分光密度显著降低（P<0.05）。β-细辛醚组、氟西汀组积分光密度介于两者之间，与模型组比较明显升高（P<0.05），见图2、表1。
3 讨论
抑郁症的发病率逐年增高，并且呈现年轻化的趋势。通过孤养大鼠模拟抑郁症情境，探讨抑郁症的发生与发展机制，是目前一种可靠的研究手段。前期大量试验证实，CMUS结合孤养模式建立的大鼠抑郁模型，可以稳定的模拟抑郁症行为学表现[4-5]。并且已经发现抑郁症的发生与大鼠海马神经细胞凋亡密切相关[6]。Bcl-2是凋亡蛋白家族中最重要的一种调控蛋白，和Bax、Bad、Bak等共同构成了Bcl-2蛋白家族。有研究证实，Bax/Bcl-2的比值变化趋势更能描述细胞凋亡发生[7]。其比值升高，说明细胞发生凋亡的可能性增加，反之降低。
该实验结果表明，模型组经过21 d造模后，产生明显抑郁症状，HE染色示海马组织发生明显改变，与前期研究结果一致[8-9]。氟西汀组及β-细辛醚组经过药物灌胃后，抑郁症状减轻，并且抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，促凋亡蛋白Bax表达降低。
抑郁症的病理机理非常复杂，目前所做的研究基本是基于某一特定通路展开的研究，然而其发生与发展是多种通路共同协作产生的结果，为了更好地结合现有的研究，需要进一步完善各个通路之间的关系，以期找到治疗抑郁症的靶向因子，并使其尽早应用于临床治疗。
参考文献
[1]张亚军，王宏哲.帕金森病患者的抑郁与认知功能障碍相关关系分析[J].中国医学创新，2010，7（30）：1-3.
[2] Palazidou E.The neurobiology of depression[J].Br Med Bull，2012，101（1）：127-145.
[3]李明亚，李娟好，季宁东，等.石菖蒲几种粗提取物的抗抑郁作用[J].广东药学院学报，2004，20（2）：141.
[4]孟盼，王宇红，张秀丽，等.百事乐胶囊对慢性应激抑郁模型大鼠海马神经元凋亡的影响[J].中国实验方剂学，2013，19（19）：203-207.
[5]孙玉荣，董海影，王显艳，等.β-细辛醚对抑郁模型大鼠行为及海马神经元的影响[J].北京中医药大学学报，2013，36（8）：546-549.
[6] Zhou Q G，Hu Y，Wu D L，et al.Hippocampal Telomerase Is Involved in the Modulation of Depressive Behaviors[J].The Journal of Neuroscience，2011，31（34）：12 258-12 269.
[7]白巨利，孟紫强.p53、bax和bcl-2基因在SO2染毒大鼠肝中的表达[J].中国生物化学与分子生物学报，2006，22（4）：343-348.
[8]荣华，董海影，张静艳，等.β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马CA3区超微改变及脑组织ERK蛋白表达的影响[J].中国医学创新，2013，10（36）：10-12.
[9] Richard J P，Christopher R B，Jennifer J，et al.Cognitive remediation as a treatment for major depression： a rationale， review of evidence and recommendations for future research[J].Australian and New Zealand Journal of Psychiatry，2013，47（12）：1165-1175.
（收稿日期：2014-04-21） （本文编辑：蔡元元）
【关键词】 β-细辛醚； 海马； B细胞淋巴瘤/白血病-2； Bax
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of β-assrone on the hippocampus and the expressions of protein Bax and Bcl-2 in the hippocampus of depression model rats.Method：According to the open field test，adult Sprague-Dawley rates with similar scores were randomly divided into 4 groups， each group had 20 cases. Solitary and chronic mild unpredictability stimulation on each one except the normal control group， copy the model of depression. On the second day of a successful model replication， the fluoxetine control group and the β-asarone group were given 1.2 mg/（kg·d） the fluoxetine and 25 mg/（kg·d） the β-asarone. The model control group and the normal control group were given equal volumes of normal saline. On the 21th day， rats were to be put to death and take brain tissue. The protein expression of Bax and Bcl-2 in the hippocampus were tested by immunohistochemical staining method.Result：The numbers of neurons were reduced in the hippocampus of model group， scattered in the arrangement， the nucleus of neurons were pycnosis deformation，especially on the region of CA1 and CA3. Compared with model group， the protein expression of Bax reduced and Bcl-2 increased with statistical significance in the hippocampus in fluoxetine control group and β-asarone group（P<0.01）.Conclusion：β-asarone can reduce the protein expression of Bax， while promote the protein expression of Bcl-2 in the hippocampus of depression model rats.
【Key words】 β-asarone； Hippocampus； B celll ymphoma/leukemis-2； Bcl-2 associated X protein
First-author’s address：Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.012
抑郁症（depression）是临床较为常见的精神疾病性障碍，病因较为复杂，病程较长，发病率呈逐年上升趋势[1-2]。中药石菖蒲具有提神醒脑、开窍益智的作用，是中医治疗脑病常用药物之一，现代药理学研究提示，石菖蒲具有较好的抗抑郁作用[3]。本实验通过研究石菖蒲主要有效成分β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马区的作用，探讨其对海马神经元凋亡因子Bax（Bcl-2 associated X protein，Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemis-2，Bcl-2）表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 2～3个月龄的清洁级雄性SD大鼠，体重180～200 g，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（辽）2008-0002。
1.1.2 药品 盐酸氟西汀胶囊（由苏州俞氏药业有限公司提供），β-细辛醚标准品（由天津一方科技有限公司提供）。 1.1.3 其他材料 试剂兔抗鼠Bax抗体（购于Abcam公司）、兔抗鼠Bcl-2抗体（购于Abcam公司）。免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂、PBS缓冲液（购于福州迈新生物技术开发有限公司）。
1.1.4 仪器 光学显微镜CX11R BSF（Olympus），图像分析系统DP801（Alphamiager公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 大鼠适应性喂养1周，自由进食水。保持环境干燥，通风，温度18～20 ℃，无噪声，无人为光源。进行敞箱实验（Open-field-test），选取得分相近的80只大鼠进行分组，按随机数字表法分为四组：正常组、β-细辛醚组、氟西汀组、模型组，每组20只。
1.2.2 具体方法 除正常组外每笼单只饲养，正常组不给予任何刺激。β-细辛醚组、氟西汀组、模型组，均接受慢性轻度不可预见性应激刺激（Chronic unpredictable mild stress stimulation，CUMS）：每天进行一种不可预知的刺激，持续21 d，每种刺激使用不超过4次，避免大鼠适应刺激，刺激方法根据Katz法改进。具体方法：摇晃（30 min），倾斜鼠笼（45°，24 h），禁食水（24 h），束缚（24 h），热刺激（45 ℃，5 min），冰水游泳（4 ℃，5 min），夹尾（3 min），潮湿环境（100 g垫料中加入200 mL水，24 h）。造模开始计为第1天。第2天起，β-细辛醚组给予10 g/L的β-细辛醚组混悬液，按25 mg/（kg·d）灌胃给药。氟西汀组给予10 g/L的氟西汀混悬液，按1.2 mg/（kg·d）灌胃给药。模型组给予等量生理盐水，每天灌胃一次。
1.2.3 免疫组织化学法检测大鼠海马组织Bax、Bcl-2蛋白表达 石蜡切片脱蜡和水化后进行抗原修复。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶（SP）法进行免疫组织化学染色，并DAB显色，经过苏木素复染、PBS洗涤、盐酸乙醇分化后返蓝，常规脱水、透明、中性树胶封片。每一张切片在阳性表达区域挑选10个无重叠视野，使用Olympus显微镜、DP801形态分析软件进行图像采集处理，图像分析系统进行分析，测出Bax、Bcl-2蛋白抗原表达的总面积、阳性细胞数和平均吸光度IA，计算其积分吸光度。
1.3 统计学处理 运用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理，计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠海马区Bax蛋白表达 模型组大鼠海马区Bax蛋白表达较正常组显著增强，两组积分光密度比较差异有统计学意义（P<0.05），β-细辛醚组、氟西汀组与模型组比较积分光密度明显降低（P<0.05），见图1、表1。
2.2 各组大鼠海马区Bcl-2蛋白表达 模型组的Bcl-2蛋白表达明显低于正常组，积分光密度显著降低（P<0.05）。β-细辛醚组、氟西汀组积分光密度介于两者之间，与模型组比较明显升高（P<0.05），见图2、表1。
3 讨论
抑郁症的发病率逐年增高，并且呈现年轻化的趋势。通过孤养大鼠模拟抑郁症情境，探讨抑郁症的发生与发展机制，是目前一种可靠的研究手段。前期大量试验证实，CMUS结合孤养模式建立的大鼠抑郁模型，可以稳定的模拟抑郁症行为学表现[4-5]。并且已经发现抑郁症的发生与大鼠海马神经细胞凋亡密切相关[6]。Bcl-2是凋亡蛋白家族中最重要的一种调控蛋白，和Bax、Bad、Bak等共同构成了Bcl-2蛋白家族。有研究证实，Bax/Bcl-2的比值变化趋势更能描述细胞凋亡发生[7]。其比值升高，说明细胞发生凋亡的可能性增加，反之降低。
该实验结果表明，模型组经过21 d造模后，产生明显抑郁症状，HE染色示海马组织发生明显改变，与前期研究结果一致[8-9]。氟西汀组及β-细辛醚组经过药物灌胃后，抑郁症状减轻，并且抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，促凋亡蛋白Bax表达降低。
抑郁症的病理机理非常复杂，目前所做的研究基本是基于某一特定通路展开的研究，然而其发生与发展是多种通路共同协作产生的结果，为了更好地结合现有的研究，需要进一步完善各个通路之间的关系，以期找到治疗抑郁症的靶向因子，并使其尽早应用于临床治疗。
参考文献
[1]张亚军，王宏哲.帕金森病患者的抑郁与认知功能障碍相关关系分析[J].中国医学创新，2010，7（30）：1-3.
[2] Palazidou E.The neurobiology of depression[J].Br Med Bull，2012，101（1）：127-145.
[3]李明亚，李娟好，季宁东，等.石菖蒲几种粗提取物的抗抑郁作用[J].广东药学院学报，2004，20（2）：141.
[4]孟盼，王宇红，张秀丽，等.百事乐胶囊对慢性应激抑郁模型大鼠海马神经元凋亡的影响[J].中国实验方剂学，2013，19（19）：203-207.
[5]孙玉荣，董海影，王显艳，等.β-细辛醚对抑郁模型大鼠行为及海马神经元的影响[J].北京中医药大学学报，2013，36（8）：546-549.
[6] Zhou Q G，Hu Y，Wu D L，et al.Hippocampal Telomerase Is Involved in the Modulation of Depressive Behaviors[J].The Journal of Neuroscience，2011，31（34）：12 258-12 269.
[7]白巨利，孟紫强.p53、bax和bcl-2基因在SO2染毒大鼠肝中的表达[J].中国生物化学与分子生物学报，2006，22（4）：343-348.
[8]荣华，董海影，张静艳，等.β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马CA3区超微改变及脑组织ERK蛋白表达的影响[J].中国医学创新，2013，10（36）：10-12.
[9] Richard J P，Christopher R B，Jennifer J，et al.Cognitive remediation as a treatment for major depression： a rationale， review of evidence and recommendations for future research[J].Australian and New Zealand Journal of Psychiatry，2013，47（12）：1165-1175.
（收稿日期：2014-04-21） （本文编辑：蔡元元）