论文部分内容阅读
摘要：目的 观察酸枣仁汤对抑郁模型大鼠大脑皮质、海马中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B基因表达的影响，并探讨其作用机制。方法 将大鼠随机分为空白组、模型组、西药组和酸枣仁汤高、中、低剂量组，除空白组外，其余各组大鼠均以慢性应激法复制抑郁症模型，各给药组给予相应药物灌胃。采用RT-PCR检测大鼠皮质、海马中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B基因的表达。结果 与模型组比较，酸枣仁汤高、中剂量组大鼠皮质和海马中NMDAR1阳性表达均降低（P<0.01）；酸枣仁汤高、中剂量组和西药组皮质和海马中NMDAR2A阳性表达均降低（P<0.05，P<0.01），酸枣仁汤低剂量组海马中NMDAR2A表达增高（P<0.05）；酸枣仁汤高、中、低剂量组和西药组皮质中NMDAR2B阳性表达均降低（P<0.01），酸枣仁汤中、低剂量组海马中NMDAR2B表达增高（P<0.01）。结论 酸枣仁汤可能通过降低大鼠皮质、海马中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B基因表达达到治疗抑郁症的作用。
关键词：酸枣仁汤；抑郁症；皮质；海马；N-甲基D-天冬氨酸受体；基因表达
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0045-04
Abstract：Objectives To observe the effect of Suanzaoren Decoction on the expression of NMDAR1， NMDAR2A and NMDAR2B RNA in cortex and hippocampus of depression model rats， and explore the mechanism of treating depression. Methods Ninty SD rats were randomly divided into blank group， model group， western medicine group， Suanzaoren Decoction high， medium and low dose group. Except the blank group， the other groups were replicated the rat model of depression in chronic stress. The treatment groups were given corresponding drugs by gavage. The expression of NMDAR1， NMDAR2A and NMDAR2B genes in cortex and hippocampus were detected by RT-PCR. Results Compared with the model group， the positive expression of NMDAR in cortex and hippocampus decreased in Suanzaoren Decoction high and medium dose group （P<0.01）. The positive expression of NMDAR2A in cortex and hippocampus of Suanzaoren Decoction high， medium dose group and western medicine group decreased （P<0.05， P<0.01）， the expression of NMDAR2A in hippocampus increased in Suanzaoren Decoction low dose group （P<0.05）. The positive expression of NMDAR2B in cortex decreased in western medicine group， Suanzaoren Decoction high， medium and low dose group （P<0.01）. The expression of NMDAR2B in hippocampus increased in Suanzaoren Decoction medium and low dose group （P<0.01）. Conclusion Suanzaoren Decoction can play the role of treating depression by decreasing the expression of NMDAR1， NMDAR2A and NMDAR2B RNA in cortex and hippocampus.
Key words：Suanzaoren decoction；depression；cortex；hippocampus；NMDAR；mRNA express
抑郁症以情感低落、思维迟缓以及言语动作减少为典型症状，是一种常见的精神病理状态或综合征。抑郁症严重困扰患者的生活和工作，给家庭和社会带来沉重的负担。因此，加强抑郁症的防治，寻找积极、有效的治疗方法，具有非常重要的意义。本实验通过慢性应激和隔离孤养复制抑郁症大鼠模型，观察酸枣仁汤对抑郁模型大鼠大脑皮质、海马中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B基因表达的影响，探讨其治疗抑郁症的可能作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康清洁级SD大鼠90只，雄性，质量180～210 g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（黑）2008-004。 1.2 药物与制备
酸枣仁汤（由酸枣仁20 g、知母10 g、茯苓10 g、川芎10 g、甘草5 g组成），购于北京同仁堂黑龙江分店，取组方药材，加水约600 L，浸泡40 min后煎煮，水沸后用文火继续煎煮约40 min，过滤；第2次加水约400 mL煎煮，水沸后用文火继续煎煮40 min后过滤，合并2滤液，制成水煎剂，浓缩至相应浓度；氯丙咪嗪片（北京诺华公司生产，批号09007）融入蒸馏水中制备成相应浓度的混悬液。
1.3 试剂与仪器
2 实验方法
2.1 分组与给药
将大鼠随机分为空白组、模型组、西药组和酸枣仁汤高、中、低剂量组，每组15只，除空白组外，其余各组均单笼饲养，每笼1只。适应性喂养7 d后，称重。除空白组外，其余各组接受21 d应激刺激，刺激第2日起大鼠每100 g体质量灌胃1 mL药液，酸枣仁汤高、中、低剂量组按9.9、4.95、2.475 g/（kg·d）剂量给予酸枣仁汤灌胃，西药组按2.25 mg/（kg·d）剂量给予氯丙咪嗪灌胃，空白组和模型组给予等体积生理盐水。每日给药剂量为10 mL/kg。
2.2 造模
应用慢性轻度不可预见性应激和孤养进行抑郁症模型的复制[1]，本实验稍加改动：包括禁食24 h、禁水24 h、足底电击、夹尾3 min、昼夜颠倒24 h、改变生存环境（潮湿垫料、倾斜鼠笼等）、束缚固定3 h、4 ℃冰水游泳5 min，45 ℃热水游泳5 min等。除空白组外，第8日起进行21 d上述刺激，每日1种，随机进行，每种刺激2～3次，使动物不能预料刺激的发生。
2.3 取材
末次给药后24 h将大鼠断头处死，在冰上剥离大脑，取前皮质，分离海马，称重后加入0.1 ?g/mL NHClO4（含 0.3 mmol/L Na2EDTA，0.05 mmol/L无水亚硫酸钠，4 ℃预冷）540 ?L，超声匀浆，加入60 ?L羟苯甲酸（DHBA，0.5 ?g/mL），15 000 r/min离心15 min，取上清，过膜（0.45 ?m），待测样品于-70 ℃保存。
2.4 海马、皮质总RNA的提取
液氮碾磨组织后，加TRK Lysis Buffer裂解组织；将HiBind RNA Spin柱子套在2 mL收集管中，将上述溶液（包括沉淀）转移至柱子上，37 ℃、10 000×g离心1 min，完全滤过溶液；加300 ?L Wash Buffer Ⅰ至柱子上，按上述条件离心，弃滤出液；Dnase酶消化处理；加500 ?L RNA Wash Buffer I，37 ℃、10 000×g离心1 min，去滤液；加500 ?L的RNA Wash Buffer Ⅱ（已用无水乙醇稀释），37 ℃、10 000×g离心1 min，去滤液；加500 ?L的RNA Wash Buffer Ⅱ，37 ℃、10 000×g离心1min，去滤液。将柱子套回空的收集管，37 ℃、10 000×g离心1 min，以甩干柱子的基质；将柱子转移至新的1.5 mL收集管中，加入40 ?L DEPC水至柱子的膜中央，放置1 min。37 ℃、10 000×g离心1 min以洗脱RNA；提取RNA，-20 ℃冰箱保存备用，同时取2 ?L样品置于分光光度计检测浓度。
2.5 反转录试验
5 讨论
现代医学认为，抑郁症的发病主要是由生物、遗传、社会、环境、心理等因素综合作用的结果，对抑郁症的发病机制主要有中枢神经递质及其受体失衡假说、神经内分泌失调假说和脑源性神经营养因子失调假说等。
酸枣仁汤最早收载于张仲景的《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治》，由酸枣仁、川芎、知母、茯苓、甘草组成，用于治疗“虚劳虚烦不得眠”，疗效确切。酸收与辛散并用，补血与行血结合，具有养血调肝之妙。现代药理研究表明，酸枣仁汤除用于治疗失眠症外，还用于以情绪或神志障碍为主要表现的精神系统疾病。其抗抑郁的相关研究，杨氏等[2]发现酸枣仁汤抗抑郁作用可能与增加脑内单胺类神经递质含量有关，夏氏[3]研究发现酸枣仁汤抗抑郁作用机制与增加脑组织中的5-羟色胺、肾上腺素含量有关。
哺乳动物中枢神经系统中某些游离氨基酸可作为兴奋性神经递质参与突触传递，它们被称为兴奋性氨基酸（EAA）。其中2种最重要的内源性EAA是谷氨酸和天冬氨酸。突触后受体按其与不同外源性激动剂的结合分为2类，其中一类与N-甲基D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid， NMDA）结合称为NMDA受体。NMDA受体集中于突触后位点，某些位于突触前。NMDA通过其不同的亚单位和多个细胞内蛋白质相互作用[4]，并受基因的控制。NR2亚单位存在多个相关基因，其中2A和2B亚单位是主要的调节亚单位，选择性NMDA受体拮抗剂和激动剂的作用位点分别是NR2B和NR2A亚型[5]。一般认为慢性应激导致HPA轴系统功能亢进，使血浆糖皮质激素（GC）水平升高[6]。GC能调节海马神经元的许多基因，其中通过GR调控NMDA受体中NRl和NR2A/2B的表达就是其中之一。
实验结果表明，抑郁模型大鼠皮质、海马中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B阳性神经元表达增加，而适当剂量的酸枣仁汤可以降低大鼠皮质、海马中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B基因表达，这可能是由不同的原因导致，体现了亚基的特异性。酸枣仁汤可以使机体因应激引起的不平衡恢复正常，充分说明它对突触可塑性有明显的改善功能，因而具有良好的抗抑郁作用。其抗抑郁机制可能是通过影响GC水平，进而调控NMDA受体中NRl和NR2A/2B的表达实现的。
参考文献：
[1] 许晶.慢性应激抑郁模型的建立及其评价[J].中国行为医学科学2003，12（1）：14-17.
[2] 杨新年，张业，李霏.酸枣仁汤对抑郁模型大鼠行为学和脑组织单胺类神经递质的影响[J].河南中医学院学报，2007，22（4）：1-7.
[3] 夏寒星.酸枣仁汤抗抑郁实验研究[J].浙江中医药大学学报，2001， 1（1）：52-53.
[4] McBain CJ， Mayer ML. N-methyl-D-aspartic acid receptor structure and function[J]. Physiol Rev，1994，74：723-760.
[5] Chazot PL， Lawrence S， Thompson CL. Studies on the subtype selectivity of CP-101，606：evidence for two classes of NR2B- selective NMDA receptor antagonists[J]. Neuropharmacology， 2002，42（3）：319-324.
[6] Eronald DK， Onno C ME， Mo V. The Yin and Yang of nuclear receptors：symposium mononuclear receptors in brain[J]. Trend in Endocri Metab，2000，11：245-248.
（收稿日期：2013-09-15；编辑：华强）
关键词：酸枣仁汤；抑郁症；皮质；海马；N-甲基D-天冬氨酸受体；基因表达
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0045-04
Abstract：Objectives To observe the effect of Suanzaoren Decoction on the expression of NMDAR1， NMDAR2A and NMDAR2B RNA in cortex and hippocampus of depression model rats， and explore the mechanism of treating depression. Methods Ninty SD rats were randomly divided into blank group， model group， western medicine group， Suanzaoren Decoction high， medium and low dose group. Except the blank group， the other groups were replicated the rat model of depression in chronic stress. The treatment groups were given corresponding drugs by gavage. The expression of NMDAR1， NMDAR2A and NMDAR2B genes in cortex and hippocampus were detected by RT-PCR. Results Compared with the model group， the positive expression of NMDAR in cortex and hippocampus decreased in Suanzaoren Decoction high and medium dose group （P<0.01）. The positive expression of NMDAR2A in cortex and hippocampus of Suanzaoren Decoction high， medium dose group and western medicine group decreased （P<0.05， P<0.01）， the expression of NMDAR2A in hippocampus increased in Suanzaoren Decoction low dose group （P<0.05）. The positive expression of NMDAR2B in cortex decreased in western medicine group， Suanzaoren Decoction high， medium and low dose group （P<0.01）. The expression of NMDAR2B in hippocampus increased in Suanzaoren Decoction medium and low dose group （P<0.01）. Conclusion Suanzaoren Decoction can play the role of treating depression by decreasing the expression of NMDAR1， NMDAR2A and NMDAR2B RNA in cortex and hippocampus.
Key words：Suanzaoren decoction；depression；cortex；hippocampus；NMDAR；mRNA express
抑郁症以情感低落、思维迟缓以及言语动作减少为典型症状，是一种常见的精神病理状态或综合征。抑郁症严重困扰患者的生活和工作，给家庭和社会带来沉重的负担。因此，加强抑郁症的防治，寻找积极、有效的治疗方法，具有非常重要的意义。本实验通过慢性应激和隔离孤养复制抑郁症大鼠模型，观察酸枣仁汤对抑郁模型大鼠大脑皮质、海马中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B基因表达的影响，探讨其治疗抑郁症的可能作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康清洁级SD大鼠90只，雄性，质量180～210 g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（黑）2008-004。 1.2 药物与制备
酸枣仁汤（由酸枣仁20 g、知母10 g、茯苓10 g、川芎10 g、甘草5 g组成），购于北京同仁堂黑龙江分店，取组方药材，加水约600 L，浸泡40 min后煎煮，水沸后用文火继续煎煮约40 min，过滤；第2次加水约400 mL煎煮，水沸后用文火继续煎煮40 min后过滤，合并2滤液，制成水煎剂，浓缩至相应浓度；氯丙咪嗪片（北京诺华公司生产，批号09007）融入蒸馏水中制备成相应浓度的混悬液。
1.3 试剂与仪器
2 实验方法
2.1 分组与给药
将大鼠随机分为空白组、模型组、西药组和酸枣仁汤高、中、低剂量组，每组15只，除空白组外，其余各组均单笼饲养，每笼1只。适应性喂养7 d后，称重。除空白组外，其余各组接受21 d应激刺激，刺激第2日起大鼠每100 g体质量灌胃1 mL药液，酸枣仁汤高、中、低剂量组按9.9、4.95、2.475 g/（kg·d）剂量给予酸枣仁汤灌胃，西药组按2.25 mg/（kg·d）剂量给予氯丙咪嗪灌胃，空白组和模型组给予等体积生理盐水。每日给药剂量为10 mL/kg。
2.2 造模
应用慢性轻度不可预见性应激和孤养进行抑郁症模型的复制[1]，本实验稍加改动：包括禁食24 h、禁水24 h、足底电击、夹尾3 min、昼夜颠倒24 h、改变生存环境（潮湿垫料、倾斜鼠笼等）、束缚固定3 h、4 ℃冰水游泳5 min，45 ℃热水游泳5 min等。除空白组外，第8日起进行21 d上述刺激，每日1种，随机进行，每种刺激2～3次，使动物不能预料刺激的发生。
2.3 取材
末次给药后24 h将大鼠断头处死，在冰上剥离大脑，取前皮质，分离海马，称重后加入0.1 ?g/mL NHClO4（含 0.3 mmol/L Na2EDTA，0.05 mmol/L无水亚硫酸钠，4 ℃预冷）540 ?L，超声匀浆，加入60 ?L羟苯甲酸（DHBA，0.5 ?g/mL），15 000 r/min离心15 min，取上清，过膜（0.45 ?m），待测样品于-70 ℃保存。
2.4 海马、皮质总RNA的提取
液氮碾磨组织后，加TRK Lysis Buffer裂解组织；将HiBind RNA Spin柱子套在2 mL收集管中，将上述溶液（包括沉淀）转移至柱子上，37 ℃、10 000×g离心1 min，完全滤过溶液；加300 ?L Wash Buffer Ⅰ至柱子上，按上述条件离心，弃滤出液；Dnase酶消化处理；加500 ?L RNA Wash Buffer I，37 ℃、10 000×g离心1 min，去滤液；加500 ?L的RNA Wash Buffer Ⅱ（已用无水乙醇稀释），37 ℃、10 000×g离心1 min，去滤液；加500 ?L的RNA Wash Buffer Ⅱ，37 ℃、10 000×g离心1min，去滤液。将柱子套回空的收集管，37 ℃、10 000×g离心1 min，以甩干柱子的基质；将柱子转移至新的1.5 mL收集管中，加入40 ?L DEPC水至柱子的膜中央，放置1 min。37 ℃、10 000×g离心1 min以洗脱RNA；提取RNA，-20 ℃冰箱保存备用，同时取2 ?L样品置于分光光度计检测浓度。
2.5 反转录试验
5 讨论
现代医学认为，抑郁症的发病主要是由生物、遗传、社会、环境、心理等因素综合作用的结果，对抑郁症的发病机制主要有中枢神经递质及其受体失衡假说、神经内分泌失调假说和脑源性神经营养因子失调假说等。
酸枣仁汤最早收载于张仲景的《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治》，由酸枣仁、川芎、知母、茯苓、甘草组成，用于治疗“虚劳虚烦不得眠”，疗效确切。酸收与辛散并用，补血与行血结合，具有养血调肝之妙。现代药理研究表明，酸枣仁汤除用于治疗失眠症外，还用于以情绪或神志障碍为主要表现的精神系统疾病。其抗抑郁的相关研究，杨氏等[2]发现酸枣仁汤抗抑郁作用可能与增加脑内单胺类神经递质含量有关，夏氏[3]研究发现酸枣仁汤抗抑郁作用机制与增加脑组织中的5-羟色胺、肾上腺素含量有关。
哺乳动物中枢神经系统中某些游离氨基酸可作为兴奋性神经递质参与突触传递，它们被称为兴奋性氨基酸（EAA）。其中2种最重要的内源性EAA是谷氨酸和天冬氨酸。突触后受体按其与不同外源性激动剂的结合分为2类，其中一类与N-甲基D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid， NMDA）结合称为NMDA受体。NMDA受体集中于突触后位点，某些位于突触前。NMDA通过其不同的亚单位和多个细胞内蛋白质相互作用[4]，并受基因的控制。NR2亚单位存在多个相关基因，其中2A和2B亚单位是主要的调节亚单位，选择性NMDA受体拮抗剂和激动剂的作用位点分别是NR2B和NR2A亚型[5]。一般认为慢性应激导致HPA轴系统功能亢进，使血浆糖皮质激素（GC）水平升高[6]。GC能调节海马神经元的许多基因，其中通过GR调控NMDA受体中NRl和NR2A/2B的表达就是其中之一。
实验结果表明，抑郁模型大鼠皮质、海马中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B阳性神经元表达增加，而适当剂量的酸枣仁汤可以降低大鼠皮质、海马中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B基因表达，这可能是由不同的原因导致，体现了亚基的特异性。酸枣仁汤可以使机体因应激引起的不平衡恢复正常，充分说明它对突触可塑性有明显的改善功能，因而具有良好的抗抑郁作用。其抗抑郁机制可能是通过影响GC水平，进而调控NMDA受体中NRl和NR2A/2B的表达实现的。
参考文献：
[1] 许晶.慢性应激抑郁模型的建立及其评价[J].中国行为医学科学2003，12（1）：14-17.
[2] 杨新年，张业，李霏.酸枣仁汤对抑郁模型大鼠行为学和脑组织单胺类神经递质的影响[J].河南中医学院学报，2007，22（4）：1-7.
[3] 夏寒星.酸枣仁汤抗抑郁实验研究[J].浙江中医药大学学报，2001， 1（1）：52-53.
[4] McBain CJ， Mayer ML. N-methyl-D-aspartic acid receptor structure and function[J]. Physiol Rev，1994，74：723-760.
[5] Chazot PL， Lawrence S， Thompson CL. Studies on the subtype selectivity of CP-101，606：evidence for two classes of NR2B- selective NMDA receptor antagonists[J]. Neuropharmacology， 2002，42（3）：319-324.
[6] Eronald DK， Onno C ME， Mo V. The Yin and Yang of nuclear receptors：symposium mononuclear receptors in brain[J]. Trend in Endocri Metab，2000，11：245-248.
（收稿日期：2013-09-15；编辑：华强）