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摘要：目的 探讨缺氧诱导因子（HIF）-1α、血小板源性生长因子（PDGF）-A及PDGF-B在慢性肾功能衰竭大鼠肾组织中的表达及作用，观察六味地黄汤对其表达的影响。方法 用5/6肾切除法复制慢性肾功能衰竭模型，分假手术组，模型组和六味地黄汤组。造模后12周，检测各组肾功能指标，HE染色法观察肾组织病理变化，Masson染色法观察肾组织胶原的沉积，免疫组化法和RT-PCR法分别检测HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B在肾组织中的表达。结果 24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐在模型组明显升高（P<0.01），六味地黄汤组则明显降低（P<0.01）。模型组肾间质纤维化明显，大量胶原纤维沉积；六味地黄汤组肾间质纤维化程度明显减轻，少量胶原纤维沉积。与假手术组比较，模型组肾组织中HIF-1α、PDGF-A及PDGF-B蛋白水平和基因表达均明显升高（P<0.01）；与模型组比较，六味地黄汤组肾组织中HIF-1α、PDGF-A及PDGF-B蛋白水平和基因表达均明显降低（P<0.01），且PDGF-A和PDGF-B的表达与HIF-1α均呈正相关（P<0.01）。结论 HIF-1α可能通过上调PDGF-A和PDGF-B的表达促进肾间质纤维化，六味地黄汤可下调HIF-1α的表达，从而抑制肾间质纤维化。
关键词：慢性肾脏病；缺氧诱导因子1α；大鼠；5/6肾切除；六味地黄汤
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）04-0044-04
已有研究显示，多种病因导致的慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）普遍存在肾小管间质的缺血缺氧，慢性缺氧致肾小管间质损伤是终末期肾脏疾病的最后共同通路[1]。英国学者Fine提出的“慢性缺氧学说”成为目前CKD学界研究的热点。该学说提出，肾小管间质部分的慢性氧缺失是促进肾脏疾病进展和纤维化的重要原因[2]。缺氧可增加缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）表达，而HIF可上调结缔组织生长因子（CTGF）、血浆纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）等，促使肾间质纤维化[3]。血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）能够促进肌纤维母细胞产生胶原[4]，并通过抑制胶原酶[5]，减少细胞外基质（ECM）的降解，最终导致ECM合成增多、降解减少，过度沉积，形成纤维化。本研究旨在通过体内动物实验探讨HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B在肾间质纤维化中的表达和作用，以及六味地黄汤对其表达的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（200±10）g，湖南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（湘）2009-0001，饲养于湖南中医药大学SPF级动物房。
1.2 药物与试剂
六味地黄汤（熟地黄24 g，山药12 g，山萸肉12 g，泽泻9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）饮片购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科。先将药材用5倍自来水浸泡2 h，煮沸后再微火煎熬30 min，过滤后收集煎液，原药渣加少量水煎煮，取二煎液。将两煎液混合，于水浴恒温器上浓缩为1 g原药材/mL。一抗为兔抗大鼠HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B多克隆抗体（美国Santa Cruz），PV-6001二步法免疫组化检测试剂盒，二抗山羊抗兔IgG-HRP多聚体PV-6001（北京中杉金桥公司），DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司），Trizol（美国MRC公司），引物为英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，RT试剂盒（美国Fermentas公司），反转录试剂盒（Promega公司），Taq DNA 聚合酶和dNTPs（美国Fermentas公司）。
1.3 造模
参考文献[6]方法，以10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉动物，常规消毒铺巾，从左腹部切口，打开腹腔，静脉夹夹住肾蒂后切除左肾上下极（切除2/3），以明胶海绵压迫止血，复位肾脏，1周后进行第2次手术，切除右侧肾脏。假手术组采取同样步骤，打开腹腔暴露肾脏后避免牵拉肾脏，不切除肾脏。
1.4 分组
SD雄性大鼠适应性喂养1周后随机分为假手术组、模型组和六味地黄汤组，每组10只，模型组、六味地黄汤组均在无菌条件下进行5/6肾切除术。
1.5 给药
造模后第2日，六味地黄汤组予以六味地黄汤煎煮方灌胃，给药剂量按70 kg成人的体表面积换算。假手术组和模型组以等容积蒸馏水灌胃，每日1次，连续12周。灌胃量：10 mL/（kg·次）。各组大鼠灌胃中途死亡者予以剔除。
1.6 取材
各组大鼠均于造模12周后处死，处死前收集24 h尿液，ELISA法检测24 h尿白蛋白（24 h UAlb）；腹主动脉采血分离血清，酶法测定血肌酐（SCr）浓度，尿素酶-GLDH法测定尿素氮（BUN）浓度。肾组织分为两部分处理：①光镜观察。标本用4%多聚甲醛固定，分别进行HE染色、Masson染色及免疫组化检测；②肾组织取出后立即放入液氮罐中，随后转入-80 ℃冰箱保存待用，用于RT-PCR检测。
1.7 指标测定
1.7.1 肾脏组织学检查 肾组织经4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度为3～4 ?m）后，常规HE染色及Masson染色，Olympus 显微镜观察各组肾组织病理变化并拍照。
1.7.2 免疫组织化学法检测 免疫组化PV二步法染色，一抗用兔抗大鼠HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B抗体，二抗用相应山羊抗兔IgG-HRP多聚体（工作浓度按产品说明书配制为1∶100），染色呈棕褐色或棕黄色者为阳性染色。Olympus显微镜观察每张切片并随机选取5个视野，用麦克奥迪数码医学分析系统（Motic Med 6.0）进行图像分析。观察视野内免疫阳性细胞的平均灰度值，半定量法评估，测得组织细胞平均灰度值愈小，其蛋白水平愈高。 1.7.3 RT-PCR检测 用Trizol法提取总RNA，于15 ?L反应体系中进行反转录反应合成cDNA，PCR扩增目的基因HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B及内参基因β-actin片段。引物设计与合成：按GenBank数据库检索目的序列，Primer引物设计与分析软件设计引物。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。反应条件：94 ℃变性5 min，循环采用94 ℃变性0.5 min，56 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸0.5 min，35个循环后，72 ℃延伸10 min。引物序列：HIF-1α上游5’-GTTTACTAAA GGACAAGTCACC-3’，下游5’-TTCTGTTTGTTGAAGGGAG-3’；PDGF-A上游5’-GAGATACCCCGGGAGTTGAT-3’，下游5’-AAATGACCGTCCT GGTCTTG-3’；PDGF-B上游5’-CCCACAGTGGCTTTTCATTT-3’，下游5’-GTGGA GGAGCAGACTGAAGG-3’；内参（β-actin1）上游5’-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3’，下游5’-GCATTTGCGGTGGACGAT- 3’；内参（β-actin2）上游5’-GCCAACCGTGAAAAGATG-3’，下游5’-CCAGGATAG AGCCACCAAT-3’。以上PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统拍照分析目的条带的灰度值。
1.8 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计量资料用—x±s表示，多组均数的比较采用方差分析，组间两两比较采用最小显著差异法（LDS-t），相关分析采用Pearson相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾功能检测结果（见表1）
2.2 组织病理学检查结果
造模后12周，HE染色下假手术组肾小球结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整，间质中未见炎症细胞浸润；模型组肾小球纤维化、玻璃样变，肾小管萎缩、消失，部分肾小管发生代偿性扩张，可见蛋白管型，肾间质纤维组织增生明显及大量淋巴细胞为主炎细胞浸润；六味地黄汤组病理变化较模型组明显减轻。Masson染色下假手术组肾小球、肾小管无异常，肾间质无明显胶原纤维；模型组肾小球硬化，肾小管数量明显减少，肾间质见大量的胶原纤维；六味地黄汤组肾间质可见少量胶原纤维，纤维化程度明显减轻。
2.3 免疫组化检测结果
2.3.1 缺氧诱导因子1α的表达 造模后12周，假手术组HIF-1α在肾小管上皮细胞均有微量表达，模型组和治疗组肾小管上皮细胞胞浆和胞核中HIF-1α表达增加，尤以近曲小管表达明显，肾小球未见明显表达。
2.3.2 血小板源性生长因子A的表达 造模后12周，假手术组PDGF-A的表达不明显，模型组和六味地黄汤组肾小管上皮细胞胞浆和胞核中的PDGF-A表达增加，肾小球表达不明显。
2.3.3 血小板源性生长因子B的表达 造模后12周，假手术组PDGF-B表达不明显，模型组和六味地黄汤组肾小管上皮细胞胞浆和胞核中PDGF-B表达增加，肾小球微量表达。
2.3.4 肾组织缺氧诱导因子1α与血小板源性生长因子A、B表达半定量分析 造模后12周，肾组织HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B的表达在模型组最强，六味地黄汤组次之，假手术组最弱。模型组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B蛋白水平均明显高于假手术组（P<0.01）；六味地黄汤组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B蛋白水平均明显低于模型组（P<0.01）。见表2。PDGF-A、PDGF-B与HIF-1α的蛋白水平呈正相关。
2.4 RT-PCR检测结果
模型组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B mRNA表达均明显高于假手术组（P<0.01），六味地黄汤组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B mRNA表达均明显低于模型组（P<0.01），见图1、表3。PDGF-A、PDGF-B与HIF-1α mRNA表达呈正相关。
3 讨论
慢性肾功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是各种肾脏疾病持续进展的最终结局，其主要病理学特征为慢性肾脏纤维化。HIF-1是1992年Semenza等在低氧诱导的肝细胞癌细胞株Hep3B细胞核提取物中发现的一种蛋白质，是迄今为止发现的唯一一个在缺氧状态下发挥活性的特异性转录因子。目前研究表明，缺氧环境下肾小管上皮细胞可稳定表达HIF-1α并促进间质纤维化[7]，因此，HIF-1α可能是导致各器官纤维化的关键因子[8-9]。PDGF是从血小板中分离出的一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力。PDGF家族至少有4个亚基，即PDGF-A、B、C、D，其中PDGF-A和PDGF-B是经典的PDGF存在形式[10]。已有研究表明，PDFG表达受HIF-1α的调控。Shin等[11]在缺氧条件下体外培养胚胎干细胞，HIF-1α表达增加并可上调PDGF的表达，而在棘霉素阻断HIF-1α后，PDGF表达也随之下降。Mermis等[12]通过研究HIV转基因大鼠认为病毒蛋白诱导的氧化应激依赖于HIF-1α上调PDGF-B的表达。Ishizuka等[13]研究缺氧的间充质干细胞发现，增加细胞内超氧阴离子水平可能减轻HIF-1α表达，从而减轻缺氧诱导血管内皮生长因子和PDGF-B的转录。Mizuno等[14]研究发现，慢性缺氧导致肺动脉高压过程中，HIF-1α持续表达，并可上调PDGF的表达，促进血管平滑肌细胞增殖。另有研究表明，PDGF的表达与肝纤维化关系密切。Moon等[15]通过结扎小鼠胆总管复制肝纤维化模型，发现野生型小鼠HIF-1α蛋白水平在术后3 d明显升高，而在HIF-1α基因敲除小鼠无明显升高。在结扎后第7、14日分别检测PDGF-A、PDGF-B mRNA，发现PDGF-A、PDGF-B基因表达水平在野生型小鼠较HIF-1α基因敲除小鼠增加更明显。Copple等[16]早期研究发现，肝细胞缺氧可激活HIF-1α，后者调节PDGF-A、PDGF-B基因表达，促进肝纤维化。后来研究HIF基因敲除小鼠发现其体内的PDGF-B蛋白水平和基因表达均明显减少，从而推测HIF还可能通过上调巨噬细胞表达PDGF-B，从而促进纤维化[17]。 本研究采用的5/6肾切除法是目前研究CKD进展的理想动物模型。已有研究表明，5/6肾切除的大鼠肾脏组织中存在小动脉病变，这种小动脉病变可导致肾小球后毛细血管血流减少和小管间质缺血，而缺血就意味着低氧。Manotham等[18]研究显示，5/6肾切除的大鼠模型在发生小管纤维化前，肾小管已存在明显的缺氧。Zhang等[19]经研究5/6肾切除的大鼠模型同样显示，管周毛细血管丢失和肾小管间质缺氧在肾间质纤维化不明显之前的早期阶段（术后第3周）已经很严重，并且持续存在于肾间质纤维化的发展过程中。Zeng等[20]发现，HIF-1α在5/6肾切除大鼠肾组织中显著升高，这一结果表明慢性缺氧存在于5/6肾切除大鼠模型。俞氏等[21]研究5/6肾切除大鼠亦发现，
在早期阶段（术后第1周末），HIF-1α在肾内表达即开始增加，在术后12周仍有持续表达。本研究显示：5/6肾切除术后12周，HE和Masson染色均显示模型组存在明显纤维化，且肾功能指标均明显异常，说明造模成功。模型组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B的蛋白水平和基因表达均明显高于假手术组（P<0.01），且PDGF-A、PDGF-B的表达和HIF-1α具有相关性（P<0.01），提示HIF-1α可能通过上调PDGF-A、PDGF-B的表达促进肾脏纤维化。
六味地黄汤是临床上治疗肾阴虚证型慢性肾小球肾炎的有效方剂[22]。其临床疗效肯定，然其具体作用机制尚未阐明，何氏等[23]研究发现，给5/6肾切除大鼠灌胃六味地黄汤8周后，其血清BUN、SCr的水平明显低于模型组，并能减少留存肾系膜细胞的增生及间质纤维化，使肾切除大鼠生存期延长。蔡氏等[24]通过研究发现，六味地黄汤具有改善5/6肾切除大鼠残肾肾功能的作用，其改善残肾肾功能的作用与六味地黄汤提高肾小球的体积密切相关。缺氧是导致肾间质纤维化的重要原因，而从缺氧的角度探讨六味地黄汤干预肾间质纤维化的机理研究目前尚未见报道，本研究发现，与模型组比较，六味地黄汤组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B的蛋白水平和基因表达均明显降低，且差异均有统计学意义（P<0.01）。说明六味地黄汤可能通过改善肾组织缺氧，抑制HIF-1α表达，从而下调PDGF-A、PDGF-B的表达，达到减轻肾间质纤维化的目的。
参考文献：
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[23] 何泽云，陈江华，李晓峰.六味地黄丸对肾切除大鼠肾小球化生的影响[J].湖南中医学院学报，2004，24（2）：1-3.
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（收稿日期：2012-08-20，编辑：华强）
关键词：慢性肾脏病；缺氧诱导因子1α；大鼠；5/6肾切除；六味地黄汤
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）04-0044-04
已有研究显示，多种病因导致的慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）普遍存在肾小管间质的缺血缺氧，慢性缺氧致肾小管间质损伤是终末期肾脏疾病的最后共同通路[1]。英国学者Fine提出的“慢性缺氧学说”成为目前CKD学界研究的热点。该学说提出，肾小管间质部分的慢性氧缺失是促进肾脏疾病进展和纤维化的重要原因[2]。缺氧可增加缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）表达，而HIF可上调结缔组织生长因子（CTGF）、血浆纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）等，促使肾间质纤维化[3]。血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）能够促进肌纤维母细胞产生胶原[4]，并通过抑制胶原酶[5]，减少细胞外基质（ECM）的降解，最终导致ECM合成增多、降解减少，过度沉积，形成纤维化。本研究旨在通过体内动物实验探讨HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B在肾间质纤维化中的表达和作用，以及六味地黄汤对其表达的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（200±10）g，湖南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（湘）2009-0001，饲养于湖南中医药大学SPF级动物房。
1.2 药物与试剂
六味地黄汤（熟地黄24 g，山药12 g，山萸肉12 g，泽泻9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）饮片购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科。先将药材用5倍自来水浸泡2 h，煮沸后再微火煎熬30 min，过滤后收集煎液，原药渣加少量水煎煮，取二煎液。将两煎液混合，于水浴恒温器上浓缩为1 g原药材/mL。一抗为兔抗大鼠HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B多克隆抗体（美国Santa Cruz），PV-6001二步法免疫组化检测试剂盒，二抗山羊抗兔IgG-HRP多聚体PV-6001（北京中杉金桥公司），DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司），Trizol（美国MRC公司），引物为英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，RT试剂盒（美国Fermentas公司），反转录试剂盒（Promega公司），Taq DNA 聚合酶和dNTPs（美国Fermentas公司）。
1.3 造模
参考文献[6]方法，以10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉动物，常规消毒铺巾，从左腹部切口，打开腹腔，静脉夹夹住肾蒂后切除左肾上下极（切除2/3），以明胶海绵压迫止血，复位肾脏，1周后进行第2次手术，切除右侧肾脏。假手术组采取同样步骤，打开腹腔暴露肾脏后避免牵拉肾脏，不切除肾脏。
1.4 分组
SD雄性大鼠适应性喂养1周后随机分为假手术组、模型组和六味地黄汤组，每组10只，模型组、六味地黄汤组均在无菌条件下进行5/6肾切除术。
1.5 给药
造模后第2日，六味地黄汤组予以六味地黄汤煎煮方灌胃，给药剂量按70 kg成人的体表面积换算。假手术组和模型组以等容积蒸馏水灌胃，每日1次，连续12周。灌胃量：10 mL/（kg·次）。各组大鼠灌胃中途死亡者予以剔除。
1.6 取材
各组大鼠均于造模12周后处死，处死前收集24 h尿液，ELISA法检测24 h尿白蛋白（24 h UAlb）；腹主动脉采血分离血清，酶法测定血肌酐（SCr）浓度，尿素酶-GLDH法测定尿素氮（BUN）浓度。肾组织分为两部分处理：①光镜观察。标本用4%多聚甲醛固定，分别进行HE染色、Masson染色及免疫组化检测；②肾组织取出后立即放入液氮罐中，随后转入-80 ℃冰箱保存待用，用于RT-PCR检测。
1.7 指标测定
1.7.1 肾脏组织学检查 肾组织经4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度为3～4 ?m）后，常规HE染色及Masson染色，Olympus 显微镜观察各组肾组织病理变化并拍照。
1.7.2 免疫组织化学法检测 免疫组化PV二步法染色，一抗用兔抗大鼠HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B抗体，二抗用相应山羊抗兔IgG-HRP多聚体（工作浓度按产品说明书配制为1∶100），染色呈棕褐色或棕黄色者为阳性染色。Olympus显微镜观察每张切片并随机选取5个视野，用麦克奥迪数码医学分析系统（Motic Med 6.0）进行图像分析。观察视野内免疫阳性细胞的平均灰度值，半定量法评估，测得组织细胞平均灰度值愈小，其蛋白水平愈高。 1.7.3 RT-PCR检测 用Trizol法提取总RNA，于15 ?L反应体系中进行反转录反应合成cDNA，PCR扩增目的基因HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B及内参基因β-actin片段。引物设计与合成：按GenBank数据库检索目的序列，Primer引物设计与分析软件设计引物。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。反应条件：94 ℃变性5 min，循环采用94 ℃变性0.5 min，56 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸0.5 min，35个循环后，72 ℃延伸10 min。引物序列：HIF-1α上游5’-GTTTACTAAA GGACAAGTCACC-3’，下游5’-TTCTGTTTGTTGAAGGGAG-3’；PDGF-A上游5’-GAGATACCCCGGGAGTTGAT-3’，下游5’-AAATGACCGTCCT GGTCTTG-3’；PDGF-B上游5’-CCCACAGTGGCTTTTCATTT-3’，下游5’-GTGGA GGAGCAGACTGAAGG-3’；内参（β-actin1）上游5’-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3’，下游5’-GCATTTGCGGTGGACGAT- 3’；内参（β-actin2）上游5’-GCCAACCGTGAAAAGATG-3’，下游5’-CCAGGATAG AGCCACCAAT-3’。以上PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统拍照分析目的条带的灰度值。
1.8 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计量资料用—x±s表示，多组均数的比较采用方差分析，组间两两比较采用最小显著差异法（LDS-t），相关分析采用Pearson相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾功能检测结果（见表1）
2.2 组织病理学检查结果
造模后12周，HE染色下假手术组肾小球结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整，间质中未见炎症细胞浸润；模型组肾小球纤维化、玻璃样变，肾小管萎缩、消失，部分肾小管发生代偿性扩张，可见蛋白管型，肾间质纤维组织增生明显及大量淋巴细胞为主炎细胞浸润；六味地黄汤组病理变化较模型组明显减轻。Masson染色下假手术组肾小球、肾小管无异常，肾间质无明显胶原纤维；模型组肾小球硬化，肾小管数量明显减少，肾间质见大量的胶原纤维；六味地黄汤组肾间质可见少量胶原纤维，纤维化程度明显减轻。
2.3 免疫组化检测结果
2.3.1 缺氧诱导因子1α的表达 造模后12周，假手术组HIF-1α在肾小管上皮细胞均有微量表达，模型组和治疗组肾小管上皮细胞胞浆和胞核中HIF-1α表达增加，尤以近曲小管表达明显，肾小球未见明显表达。
2.3.2 血小板源性生长因子A的表达 造模后12周，假手术组PDGF-A的表达不明显，模型组和六味地黄汤组肾小管上皮细胞胞浆和胞核中的PDGF-A表达增加，肾小球表达不明显。
2.3.3 血小板源性生长因子B的表达 造模后12周，假手术组PDGF-B表达不明显，模型组和六味地黄汤组肾小管上皮细胞胞浆和胞核中PDGF-B表达增加，肾小球微量表达。
2.3.4 肾组织缺氧诱导因子1α与血小板源性生长因子A、B表达半定量分析 造模后12周，肾组织HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B的表达在模型组最强，六味地黄汤组次之，假手术组最弱。模型组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B蛋白水平均明显高于假手术组（P<0.01）；六味地黄汤组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B蛋白水平均明显低于模型组（P<0.01）。见表2。PDGF-A、PDGF-B与HIF-1α的蛋白水平呈正相关。
2.4 RT-PCR检测结果
模型组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B mRNA表达均明显高于假手术组（P<0.01），六味地黄汤组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B mRNA表达均明显低于模型组（P<0.01），见图1、表3。PDGF-A、PDGF-B与HIF-1α mRNA表达呈正相关。
3 讨论
慢性肾功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是各种肾脏疾病持续进展的最终结局，其主要病理学特征为慢性肾脏纤维化。HIF-1是1992年Semenza等在低氧诱导的肝细胞癌细胞株Hep3B细胞核提取物中发现的一种蛋白质，是迄今为止发现的唯一一个在缺氧状态下发挥活性的特异性转录因子。目前研究表明，缺氧环境下肾小管上皮细胞可稳定表达HIF-1α并促进间质纤维化[7]，因此，HIF-1α可能是导致各器官纤维化的关键因子[8-9]。PDGF是从血小板中分离出的一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力。PDGF家族至少有4个亚基，即PDGF-A、B、C、D，其中PDGF-A和PDGF-B是经典的PDGF存在形式[10]。已有研究表明，PDFG表达受HIF-1α的调控。Shin等[11]在缺氧条件下体外培养胚胎干细胞，HIF-1α表达增加并可上调PDGF的表达，而在棘霉素阻断HIF-1α后，PDGF表达也随之下降。Mermis等[12]通过研究HIV转基因大鼠认为病毒蛋白诱导的氧化应激依赖于HIF-1α上调PDGF-B的表达。Ishizuka等[13]研究缺氧的间充质干细胞发现，增加细胞内超氧阴离子水平可能减轻HIF-1α表达，从而减轻缺氧诱导血管内皮生长因子和PDGF-B的转录。Mizuno等[14]研究发现，慢性缺氧导致肺动脉高压过程中，HIF-1α持续表达，并可上调PDGF的表达，促进血管平滑肌细胞增殖。另有研究表明，PDGF的表达与肝纤维化关系密切。Moon等[15]通过结扎小鼠胆总管复制肝纤维化模型，发现野生型小鼠HIF-1α蛋白水平在术后3 d明显升高，而在HIF-1α基因敲除小鼠无明显升高。在结扎后第7、14日分别检测PDGF-A、PDGF-B mRNA，发现PDGF-A、PDGF-B基因表达水平在野生型小鼠较HIF-1α基因敲除小鼠增加更明显。Copple等[16]早期研究发现，肝细胞缺氧可激活HIF-1α，后者调节PDGF-A、PDGF-B基因表达，促进肝纤维化。后来研究HIF基因敲除小鼠发现其体内的PDGF-B蛋白水平和基因表达均明显减少，从而推测HIF还可能通过上调巨噬细胞表达PDGF-B，从而促进纤维化[17]。 本研究采用的5/6肾切除法是目前研究CKD进展的理想动物模型。已有研究表明，5/6肾切除的大鼠肾脏组织中存在小动脉病变，这种小动脉病变可导致肾小球后毛细血管血流减少和小管间质缺血，而缺血就意味着低氧。Manotham等[18]研究显示，5/6肾切除的大鼠模型在发生小管纤维化前，肾小管已存在明显的缺氧。Zhang等[19]经研究5/6肾切除的大鼠模型同样显示，管周毛细血管丢失和肾小管间质缺氧在肾间质纤维化不明显之前的早期阶段（术后第3周）已经很严重，并且持续存在于肾间质纤维化的发展过程中。Zeng等[20]发现，HIF-1α在5/6肾切除大鼠肾组织中显著升高，这一结果表明慢性缺氧存在于5/6肾切除大鼠模型。俞氏等[21]研究5/6肾切除大鼠亦发现，
在早期阶段（术后第1周末），HIF-1α在肾内表达即开始增加，在术后12周仍有持续表达。本研究显示：5/6肾切除术后12周，HE和Masson染色均显示模型组存在明显纤维化，且肾功能指标均明显异常，说明造模成功。模型组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B的蛋白水平和基因表达均明显高于假手术组（P<0.01），且PDGF-A、PDGF-B的表达和HIF-1α具有相关性（P<0.01），提示HIF-1α可能通过上调PDGF-A、PDGF-B的表达促进肾脏纤维化。
六味地黄汤是临床上治疗肾阴虚证型慢性肾小球肾炎的有效方剂[22]。其临床疗效肯定，然其具体作用机制尚未阐明，何氏等[23]研究发现，给5/6肾切除大鼠灌胃六味地黄汤8周后，其血清BUN、SCr的水平明显低于模型组，并能减少留存肾系膜细胞的增生及间质纤维化，使肾切除大鼠生存期延长。蔡氏等[24]通过研究发现，六味地黄汤具有改善5/6肾切除大鼠残肾肾功能的作用，其改善残肾肾功能的作用与六味地黄汤提高肾小球的体积密切相关。缺氧是导致肾间质纤维化的重要原因，而从缺氧的角度探讨六味地黄汤干预肾间质纤维化的机理研究目前尚未见报道，本研究发现，与模型组比较，六味地黄汤组HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B的蛋白水平和基因表达均明显降低，且差异均有统计学意义（P<0.01）。说明六味地黄汤可能通过改善肾组织缺氧，抑制HIF-1α表达，从而下调PDGF-A、PDGF-B的表达，达到减轻肾间质纤维化的目的。
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（收稿日期：2012-08-20，编辑：华强）