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【摘要】 目的 检测特异性人免疫球蛋白的制品相应抗体含量变化情况。方法 采用留样观察法和加速试验法对不同温度条件下的特异性人免疫球蛋白有效期进行预测。结果 乙型肝炎人免疫球蛋白（HBTG）和破伤风人免疫球蛋白（TIG）于2℃～8℃存放时较为稳定，分别是放置3年、1年所检测的各项指标均无明显变化。结论 特异性人免疫球蛋白的有效期确定应以常规观察测得的结果为最可靠的依据。
【关键词】 特异性人免疫球蛋白 HBIG TIG 稳定性试验
特异性人免疫球蛋白是用疫苗或毒素免疫人体使其血浆产生高效价抗体，经低温乙醇蛋白分离法制备并经低pH放孵病毒灭活处理的特异性免疫球蛋白制剂，与抗毒素及抗血清相比，特异性人免疫球蛋白在使用过程中不会发生因注射异种蛋白而产生严重的过敏反应，其抗体在患者体内维持时间较长。随着我国医疗及健康水平的不断提高，特异性人免疫球蛋白在临床上的使用越来越受到关注[1，2]。特异性人免疫球蛋白主要使用成分是IgG，含有针对各种不同抗原的抗体，本文对其稳定性的观察是以抗体活性变化作为主要考察指标，并以HBIG、TIG两种制品为代表，通过制品在不同温度下放置一定时间后，检测其抗体效价等项指标的变化来了解制品的稳定性，以确定其有效期，现将有关试验方法及结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 特异性人免疫球蛋白（HBIG、TIG） 均由兰州生物制品研究所采用低温乙醇工艺结合低pH放孵灭活病毒步骤制备而成（批号分别为HBIG：20030701、20030702、20030703，200IU/支；TIG：20070401、20070402、20070403，250IU/支，均为液体剂型）。
1.1.2 乙型肝炎表面抗体 抗-HBs放射免疫分析试剂盒：3V诊断技术公司提供。
1.1.3 抗-HBs、TIG标准品 均由中国药品生物制品检定所提供。
1.1.4 仪器设备 γ-计数器，2008G型，国营二六二厂生产；HPLC色谱柱：日本产G3000SW，规格7.5mm×300mm；紫外可见分光光度计：U-2001，日本日立公司。
1.2 方法
1.2.1 抗-HBs效价 按2000年版《中国生物制品规程》制定，各样品测定均重复1次，按均值计算。
1.2.2 抗-TT效价 按《中华人民共和国药典》2005年版（三部）附录ⅪF破伤风抗毒素效价测定法进行，并将其检测结果与ELISA法测定结果进行比较。
1.2.3 HBIG、TIG的单体加二聚体的检查 均按《中华人民共和国药典》2005年版（三部）的要求进行。
1.2.4 留样观察法 将兰州生物制品研究所制备的HBIG制品置于2℃～8℃、（24±1）℃、（37±1）℃，分别于0、3、6、12、18、24及36个月取出，检测其有关质量指标，同样将上述来源的破伤风人免疫球蛋白的（TIG）置于（6±2）℃，于0、3、6、9、12个月取样，置于（25±2）℃，于0、1、2、3、6个月取样，检测其有关质量指标。
2 结果
2.1 抗体效价
2.1.1 抗-HBs效价 乙型肝炎人免疫球蛋白的抗-HBs效价在不同放置条件下的变化结果见表1。结果显示，制品在2℃～8℃存放3年时，抗-HBs效价无明显改变，在（24±1）℃存放1年半时，抗-HBs效价平均下降 32.8%，在（37±1）℃存放3个月后，抗-HBs效价开始明显降低。表1 HBIG在不同放置条件下的抗-HBs效价
2.1.2 抗-TT效价 破伤风人免疫球蛋白的抗-TT效价在不同放置条件下的变化结果见表2，结果显示，该制品在（6±2）℃存放1年时，破伤风抗体效价无明显改变；在（25±2）℃存放半年时，破伤风抗体效价平均下降10.41%。
2.2 IgG单体加双体 特异性人免疫球蛋白中的IgG易于聚合，其中HBIG在2℃～8℃存放3年后，IgG单体加双体平均下降了1.26%；TIG在（6±2）℃存放1年后，IgG单体加双体平均下降了1.14%。但上述两种制品在（24±1）℃存放6个月后单体加双体的总和开始明显下降，其变化情况分别见表3、表4。表2 TIG在不同放置条件下的抗-TT效价表3 HBIG IgG单体加双体在不同条件下放置后的变化表4 TIG IgG单体加双体在不同条件下放置后的变化
2.3 蛋白质含量及纯度 HBIG、TIG蛋白质含量及纯度的稳定性分别见表5、表6、表7、表8。从表中的情况反映出，HBIG样品在不同温度下[2℃～8℃、（24±1）℃、（37±1）℃]分别放置1年、2年及3年时，TIG样品在（6±2）℃和（25±2）℃下分别放置半年和1年时，蛋白质含量和纯度基本上没有发生改变，均说明这两项指标较为稳定。 表5 HBIG不同放置条件蛋白质含量变化情况 表6 HBIG不同放置条件下蛋白质纯度变化表7 TIG不同放置条件蛋白质含量变化情况表8 TIG不同放置条件下蛋白质纯度变化
3 讨论
生物制品稳定性试验，长期以来大多采用留样观察法，此法是在不同温度下放置考察药物制剂的稳定性，是考察药物稳定性的最可靠方法，能准确真实地反映制品稳定性的实际情况。本文进行的稳定性试验的方法依据《中华人民共和国药典》2005年版附录ⅪⅩC“原料药与药物制剂稳定性试验发表原则”[3]，在人免疫球蛋白、静注人免疫球蛋白（pH 4）稳定性试验的基础上[4，5]，试验样品在（25±2）℃条件下放置6个月进行加速稳定性试验，在（6±2）℃条件下放置12个月、18个月、36个月进行长期试验，分别检测特异性人免疫球蛋白样品外观、pH值、抗体效价、纯度、蛋白质含量、IgG单体加双体、无菌检查、热原质检查等多项指标，以观察其理化及生物学活性的变化情况，为确定此产品的有效期。
特异性人免疫球蛋白有别于其他药物制剂，其分子量为15万左右，因其作用成分为蛋白质，易受各种物理或化学因素的影响而出现裂解、聚合、变性等变化，造成其生物学功能下降或损失，从而使疗效降低甚至失效，因此应用上述方法进行特异性人免疫球蛋白稳定性观察，对制品有效期的确定也仅是提供参考数据。其有效期确定还应以常规留样观察法测定的稳定性结果作为主要依据。
【参考文献】
1 周海云，江丽君.人破伤风免疫球蛋白及其应用.微生物学免疫学进展，2006，34（2）：84-86.
2 周海云，曾鸣.乙型肝炎人免疫球蛋白的应用研究.中国生物制品学杂志，2006，19（5）：544-547.
3 国家药典委员会编，中华人民共和国药典（三部）（附录）.北京：化学工业出版社，2005，176-179.
4 刘燕，李振平，周耀东，等.人免疫球蛋白稳定性的两种试验方法结果比较.微生物学免疫学进行，2003，31（4）：50-53.
5 陈平全，杨琳，栗克善.冻干低pH静注丙球质量稳定性观察.微生物学免疫学进展，1998，26（3）：30-32.
【关键词】 特异性人免疫球蛋白 HBIG TIG 稳定性试验
特异性人免疫球蛋白是用疫苗或毒素免疫人体使其血浆产生高效价抗体，经低温乙醇蛋白分离法制备并经低pH放孵病毒灭活处理的特异性免疫球蛋白制剂，与抗毒素及抗血清相比，特异性人免疫球蛋白在使用过程中不会发生因注射异种蛋白而产生严重的过敏反应，其抗体在患者体内维持时间较长。随着我国医疗及健康水平的不断提高，特异性人免疫球蛋白在临床上的使用越来越受到关注[1，2]。特异性人免疫球蛋白主要使用成分是IgG，含有针对各种不同抗原的抗体，本文对其稳定性的观察是以抗体活性变化作为主要考察指标，并以HBIG、TIG两种制品为代表，通过制品在不同温度下放置一定时间后，检测其抗体效价等项指标的变化来了解制品的稳定性，以确定其有效期，现将有关试验方法及结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 特异性人免疫球蛋白（HBIG、TIG） 均由兰州生物制品研究所采用低温乙醇工艺结合低pH放孵灭活病毒步骤制备而成（批号分别为HBIG：20030701、20030702、20030703，200IU/支；TIG：20070401、20070402、20070403，250IU/支，均为液体剂型）。
1.1.2 乙型肝炎表面抗体 抗-HBs放射免疫分析试剂盒：3V诊断技术公司提供。
1.1.3 抗-HBs、TIG标准品 均由中国药品生物制品检定所提供。
1.1.4 仪器设备 γ-计数器，2008G型，国营二六二厂生产；HPLC色谱柱：日本产G3000SW，规格7.5mm×300mm；紫外可见分光光度计：U-2001，日本日立公司。
1.2 方法
1.2.1 抗-HBs效价 按2000年版《中国生物制品规程》制定，各样品测定均重复1次，按均值计算。
1.2.2 抗-TT效价 按《中华人民共和国药典》2005年版（三部）附录ⅪF破伤风抗毒素效价测定法进行，并将其检测结果与ELISA法测定结果进行比较。
1.2.3 HBIG、TIG的单体加二聚体的检查 均按《中华人民共和国药典》2005年版（三部）的要求进行。
1.2.4 留样观察法 将兰州生物制品研究所制备的HBIG制品置于2℃～8℃、（24±1）℃、（37±1）℃，分别于0、3、6、12、18、24及36个月取出，检测其有关质量指标，同样将上述来源的破伤风人免疫球蛋白的（TIG）置于（6±2）℃，于0、3、6、9、12个月取样，置于（25±2）℃，于0、1、2、3、6个月取样，检测其有关质量指标。
2 结果
2.1 抗体效价
2.1.1 抗-HBs效价 乙型肝炎人免疫球蛋白的抗-HBs效价在不同放置条件下的变化结果见表1。结果显示，制品在2℃～8℃存放3年时，抗-HBs效价无明显改变，在（24±1）℃存放1年半时，抗-HBs效价平均下降 32.8%，在（37±1）℃存放3个月后，抗-HBs效价开始明显降低。表1 HBIG在不同放置条件下的抗-HBs效价
2.1.2 抗-TT效价 破伤风人免疫球蛋白的抗-TT效价在不同放置条件下的变化结果见表2，结果显示，该制品在（6±2）℃存放1年时，破伤风抗体效价无明显改变；在（25±2）℃存放半年时，破伤风抗体效价平均下降10.41%。
2.2 IgG单体加双体 特异性人免疫球蛋白中的IgG易于聚合，其中HBIG在2℃～8℃存放3年后，IgG单体加双体平均下降了1.26%；TIG在（6±2）℃存放1年后，IgG单体加双体平均下降了1.14%。但上述两种制品在（24±1）℃存放6个月后单体加双体的总和开始明显下降，其变化情况分别见表3、表4。表2 TIG在不同放置条件下的抗-TT效价表3 HBIG IgG单体加双体在不同条件下放置后的变化表4 TIG IgG单体加双体在不同条件下放置后的变化
2.3 蛋白质含量及纯度 HBIG、TIG蛋白质含量及纯度的稳定性分别见表5、表6、表7、表8。从表中的情况反映出，HBIG样品在不同温度下[2℃～8℃、（24±1）℃、（37±1）℃]分别放置1年、2年及3年时，TIG样品在（6±2）℃和（25±2）℃下分别放置半年和1年时，蛋白质含量和纯度基本上没有发生改变，均说明这两项指标较为稳定。 表5 HBIG不同放置条件蛋白质含量变化情况 表6 HBIG不同放置条件下蛋白质纯度变化表7 TIG不同放置条件蛋白质含量变化情况表8 TIG不同放置条件下蛋白质纯度变化
3 讨论
生物制品稳定性试验，长期以来大多采用留样观察法，此法是在不同温度下放置考察药物制剂的稳定性，是考察药物稳定性的最可靠方法，能准确真实地反映制品稳定性的实际情况。本文进行的稳定性试验的方法依据《中华人民共和国药典》2005年版附录ⅪⅩC“原料药与药物制剂稳定性试验发表原则”[3]，在人免疫球蛋白、静注人免疫球蛋白（pH 4）稳定性试验的基础上[4，5]，试验样品在（25±2）℃条件下放置6个月进行加速稳定性试验，在（6±2）℃条件下放置12个月、18个月、36个月进行长期试验，分别检测特异性人免疫球蛋白样品外观、pH值、抗体效价、纯度、蛋白质含量、IgG单体加双体、无菌检查、热原质检查等多项指标，以观察其理化及生物学活性的变化情况，为确定此产品的有效期。
特异性人免疫球蛋白有别于其他药物制剂，其分子量为15万左右，因其作用成分为蛋白质，易受各种物理或化学因素的影响而出现裂解、聚合、变性等变化，造成其生物学功能下降或损失，从而使疗效降低甚至失效，因此应用上述方法进行特异性人免疫球蛋白稳定性观察，对制品有效期的确定也仅是提供参考数据。其有效期确定还应以常规留样观察法测定的稳定性结果作为主要依据。
【参考文献】
1 周海云，江丽君.人破伤风免疫球蛋白及其应用.微生物学免疫学进展，2006，34（2）：84-86.
2 周海云，曾鸣.乙型肝炎人免疫球蛋白的应用研究.中国生物制品学杂志，2006，19（5）：544-547.
3 国家药典委员会编，中华人民共和国药典（三部）（附录）.北京：化学工业出版社，2005，176-179.
4 刘燕，李振平，周耀东，等.人免疫球蛋白稳定性的两种试验方法结果比较.微生物学免疫学进行，2003，31（4）：50-53.
5 陈平全，杨琳，栗克善.冻干低pH静注丙球质量稳定性观察.微生物学免疫学进展，1998，26（3）：30-32.