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【摘要】目的：研究含益生元的婴儿配方奶对肠道菌群和双歧杆菌种群结构的影响。方法：以健康足月剖宫娩出婴儿为研究对象，含益生元配方组（实验组）、标准配方组（对照组）、母乳喂养组（母乳组）各50例。在婴儿42天、3月时采集粪便标本，应用实时荧光定量PCR技术对肠道梭菌、大肠杆菌、双歧杆菌及双歧杆菌某些重要亚种如长双歧杆菌等，进行定量检测。结果：婴儿42天时，三组肠道菌群及双歧杆菌种群结构差异无统计学意义（P >0.05）；3月时，实验组有害菌群梭菌和大肠杆菌的比例比对照组低（P <0.05），且更接近母乳喂养组；同时实验组双歧杆菌比例、长双歧杆菌及短双歧杆菌数量均比对照组高（P <0.05），且更接近母乳喂养组。结论：3月内随着月龄生长，使用含益生元配方奶健康婴儿的肠道菌群及双歧杆菌种群结构的改变逐渐接近于母乳喂养婴儿。
【关键词】益生元 婴儿 肠道菌群 双歧杆菌
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）10-0006-02
母乳喂养是婴儿获得以双歧杆菌为主导的肠道菌群，增强免疫功能和抗感染能力的最佳选择。母乳中的某些成分如低聚糖，对于正常肠道菌群建立的作用至关重要。由于自身体质、环境、工作等因素，很多母亲无法哺乳，婴儿配方乳是这些婴儿的唯一选择。本研究对使用添加益生元的配方奶健康足月婴儿前三个月肠道双歧杆菌种群进行定量分析，以观察配方奶对肠道菌群和双歧杆菌种群结构的可能影响，现报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择2010年7月至2011年12月我院产科剖宫娩出的150例健康的足月婴儿，自愿人工喂养100例及纯母乳喂养50例为观察对象，连续观察其生后三月内肠道双歧杆菌的定植发展过程并对其菌种组成进行定量分析。入选标准：健康足月剖宫产娩出婴儿（≥37孕周），出生体重2500～4000g。 排除标准：婴儿或其父母有任何明显的代谢性疾病；先天异常/出生缺陷；进入研究前患有感染性疾病，使用过抗生素、益生元或益生菌制剂。所有婴儿出生后都建议母乳喂养，不能坚持母乳喂养的婴儿（生后2周内自愿从母乳喂养转为奶粉喂养的婴儿），随机选择分为实验组（50例）： 将被提供添加益生元的配方奶粉（精装优阶贝护，多美滋公司）并持续使用直到3个月龄。 对照组：提供标准配方奶粉（多美滋公司）。母乳喂养组： 生后2周内开始纯母乳喂养的婴儿，将被录入研究并被指定入母乳喂养组。
1.2 方法
1.2.1 样本收集
3组研究对象婴儿分别在生后42天、3个月时采集粪便样本，采样后立即置入无菌大便杯，途中使用干冰保存运输，转入实验室于一80℃冰箱保存，直至粪便细菌DNA抽提。
1.2.2 标本细菌DNA的抽取
使用 QIAamp DNA stool Mini Kit （Qiagen，Hilden，Germany）抽提样品粪便内细菌基因组DNA，抽提后的DNA溶液在定量分析前冻存于一80℃冰箱内。
1.2.3 PCR引物及探针设计与合成
依据各细菌16SrRNA及16S-23SrRNA序列特异性基因序列，设计合成乳酸杆菌和双
歧杆菌种特异性引物和探针，并在BLAST基因库（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）内比对引物和探针的特异性，引物及探针由上海闪晶分子生物科技有限公司合成。
1.2.4 荧光定量PCR
双歧杆菌和乳酸杆菌的定量检测采用SYBR Green I荧光染料法。扩增条件：95℃预变性10s后，各细菌循环（双歧杆菌参数为：95℃变性10s，-60℃退火10s，-72℃延伸1min；乳酸杆菌参数为：95℃变性10s，-56℃退火10s，-72℃延伸1min），各40个循环。
双歧杆菌亚种的定量检测采用TaqMan水解探针法。长双歧杆菌和短双歧杆菌扩增条件：95℃预变性10s，95℃变性10s，-57℃退火10s，-72℃延伸20s，各45个循环；青春双歧杆菌扩增条件：95℃预变性10s，95℃变性10s，-58℃退火10s，-72℃延伸20s，45个循环。所有Real-time quantitative PCR反应于LightCycle 480（Roche）上进行。每次实验都设阴性对照，每个样本做3个平行复孔。取确定量的细菌DNA（双歧杆菌、乳酸杆菌和长双歧杆菌由上海交通大学生物医药研究所提供，短双歧杆菌和青春双歧杆菌购于中国科学院微生物研究所）10倍梯度稀释后同时进行PCR反应，作为标准曲线。
1.3 统计学分析
应用SPSS 17.0统计软件进行分析，计数资料采用卡方检验，计量资料以均数±标准差（ ）表示，采用t检验；P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组婴儿肠道菌群生长情况
第42天时三组婴儿肠道菌群生长比例差异无统计学意义（P >0.05）。第3月时，实验组双歧杆菌比例明显高于对照组，且第3月时实验组双歧杆菌比例更接近母乳喂养组；实验组有害菌群梭菌和大肠杆菌的比例均比对照组低，且更接近母乳喂養组。（* P <0.05，与对照组相比有统计学意义）。见表1.
2.2 三组婴儿双歧杆菌菌种定量检测结果
双歧杆菌种群中长双歧杆菌检出率较高，短双歧杆菌检出率相对较低，而青春双歧杆菌检出率更低（仅母乳组检出1例）。实验第42天时，长双歧杆菌及短双歧杆菌生长数量均表现为：母乳组>实验组>对照组，实验组、对照组之间差异无统计学意义（P >0.05）；实验第3月时，长双歧杆菌及短双歧杆菌生长数量均表现为：实验组> 母乳组>对照组，实验组、对照组之间差异有统计学意义（P <0.05）。见表2.
【关键词】益生元 婴儿 肠道菌群 双歧杆菌
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）10-0006-02
母乳喂养是婴儿获得以双歧杆菌为主导的肠道菌群，增强免疫功能和抗感染能力的最佳选择。母乳中的某些成分如低聚糖，对于正常肠道菌群建立的作用至关重要。由于自身体质、环境、工作等因素，很多母亲无法哺乳，婴儿配方乳是这些婴儿的唯一选择。本研究对使用添加益生元的配方奶健康足月婴儿前三个月肠道双歧杆菌种群进行定量分析，以观察配方奶对肠道菌群和双歧杆菌种群结构的可能影响，现报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择2010年7月至2011年12月我院产科剖宫娩出的150例健康的足月婴儿，自愿人工喂养100例及纯母乳喂养50例为观察对象，连续观察其生后三月内肠道双歧杆菌的定植发展过程并对其菌种组成进行定量分析。入选标准：健康足月剖宫产娩出婴儿（≥37孕周），出生体重2500～4000g。 排除标准：婴儿或其父母有任何明显的代谢性疾病；先天异常/出生缺陷；进入研究前患有感染性疾病，使用过抗生素、益生元或益生菌制剂。所有婴儿出生后都建议母乳喂养，不能坚持母乳喂养的婴儿（生后2周内自愿从母乳喂养转为奶粉喂养的婴儿），随机选择分为实验组（50例）： 将被提供添加益生元的配方奶粉（精装优阶贝护，多美滋公司）并持续使用直到3个月龄。 对照组：提供标准配方奶粉（多美滋公司）。母乳喂养组： 生后2周内开始纯母乳喂养的婴儿，将被录入研究并被指定入母乳喂养组。
1.2 方法
1.2.1 样本收集
3组研究对象婴儿分别在生后42天、3个月时采集粪便样本，采样后立即置入无菌大便杯，途中使用干冰保存运输，转入实验室于一80℃冰箱保存，直至粪便细菌DNA抽提。
1.2.2 标本细菌DNA的抽取
使用 QIAamp DNA stool Mini Kit （Qiagen，Hilden，Germany）抽提样品粪便内细菌基因组DNA，抽提后的DNA溶液在定量分析前冻存于一80℃冰箱内。
1.2.3 PCR引物及探针设计与合成
依据各细菌16SrRNA及16S-23SrRNA序列特异性基因序列，设计合成乳酸杆菌和双
歧杆菌种特异性引物和探针，并在BLAST基因库（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）内比对引物和探针的特异性，引物及探针由上海闪晶分子生物科技有限公司合成。
1.2.4 荧光定量PCR
双歧杆菌和乳酸杆菌的定量检测采用SYBR Green I荧光染料法。扩增条件：95℃预变性10s后，各细菌循环（双歧杆菌参数为：95℃变性10s，-60℃退火10s，-72℃延伸1min；乳酸杆菌参数为：95℃变性10s，-56℃退火10s，-72℃延伸1min），各40个循环。
双歧杆菌亚种的定量检测采用TaqMan水解探针法。长双歧杆菌和短双歧杆菌扩增条件：95℃预变性10s，95℃变性10s，-57℃退火10s，-72℃延伸20s，各45个循环；青春双歧杆菌扩增条件：95℃预变性10s，95℃变性10s，-58℃退火10s，-72℃延伸20s，45个循环。所有Real-time quantitative PCR反应于LightCycle 480（Roche）上进行。每次实验都设阴性对照，每个样本做3个平行复孔。取确定量的细菌DNA（双歧杆菌、乳酸杆菌和长双歧杆菌由上海交通大学生物医药研究所提供，短双歧杆菌和青春双歧杆菌购于中国科学院微生物研究所）10倍梯度稀释后同时进行PCR反应，作为标准曲线。
1.3 统计学分析
应用SPSS 17.0统计软件进行分析，计数资料采用卡方检验，计量资料以均数±标准差（ ）表示，采用t检验；P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组婴儿肠道菌群生长情况
第42天时三组婴儿肠道菌群生长比例差异无统计学意义（P >0.05）。第3月时，实验组双歧杆菌比例明显高于对照组，且第3月时实验组双歧杆菌比例更接近母乳喂养组；实验组有害菌群梭菌和大肠杆菌的比例均比对照组低，且更接近母乳喂養组。（* P <0.05，与对照组相比有统计学意义）。见表1.
2.2 三组婴儿双歧杆菌菌种定量检测结果
双歧杆菌种群中长双歧杆菌检出率较高，短双歧杆菌检出率相对较低，而青春双歧杆菌检出率更低（仅母乳组检出1例）。实验第42天时，长双歧杆菌及短双歧杆菌生长数量均表现为：母乳组>实验组>对照组，实验组、对照组之间差异无统计学意义（P >0.05）；实验第3月时，长双歧杆菌及短双歧杆菌生长数量均表现为：实验组> 母乳组>对照组，实验组、对照组之间差异有统计学意义（P <0.05）。见表2.