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【摘 要】 了解丙酮酸氧化酶速率法在大批量献血员ALT检测中的适用性。方法：利用丙酮酸氧化酶氧化丙酮酸生成过氧化氢，过氧化氢与2,4,6三溴-3-羟基苯甲酸和4-氨基氨替比林在过氧化物酶作用下生成红色醌类化合物。结果：该方法线性范围达200u/l，与紫外酶偶联速率法比较，相关系数r=0.991，y=1.072x＋1.032，n=90。结论：该方法操作简单、快速，结果准确，灵敏度高，重复性好，特别适合血站大批量献血员ALT检测。
目前，各级血液中心、血站常用的ALT检测方法有赖氏法、速率法、酮体粉法，但由于赖氏法(60min)反应时间较长，酮体粉法准确性差等特点，均不适用于基层血站大规模的无偿献血活动[1]。自2007年我站使用丙酮酸氧化酶速率法以来，收效良好，该方法使用基层血站必备的酶标仪即可，而且操作简单、快速，具有较高的精密度和准确性，有很好的重复性，非常适合基层血站大批量献血员ALT的控制。
1 材料和方法
1.1 仪器
酶标仪（Multiskan MK3，芬兰Labsystems公司产品），TDA40FA全自动生化分析仪（日本东芝公司产品）。
1.2 试剂
丙氨酸氨基转移酶ALT/GPT试剂盒，（北京倍肯恒业科技发展有限责任公司 ）
1.3 质控血清
由北京倍肯恒业科技发展有限责任公司提供，经全自动生化分析仪确认，低值血清(L)，51u/l，高值血清(H)，103u/l。
1.4 反应原理
L-丙氨酸＋α-酮戊二酸 丙酮酸＋L-谷氨酸
丙酮酸＋O2＋P H2O2＋乙酰磷酸
H2O2＋4-AAP＋TBHBA 红色醌类化合物
1.5 测定方法
取96孔酶标板上，A1孔为试剂空白、B1孔为标准，C1及D1孔为质控，A2~H12孔为测定。于A1孔内加蒸馏水20ul，于B1孔内加标准血清20ul；C1及D1孔分别加低值及高值质控血清20ul；A2~H12孔内分别加受检血清20ul，然后各孔加工作液200ul，混匀，置37℃反应10分钟时第一次比色吸光度为A1及13分钟时第二次比色吸光度为A2(即用双时测量模式即二点测量模式)，主波长为492nm，次波长为620nm，计算各孔吸光度之差值(A2-A1)。
计算：ALT活性(u/l)=测定孔吸光度／标准孔吸光度×标准血清(u/l)
2 实验结果与讨论
2.1 线性
取1份ALT活性200u/l的血清，用生理盐水稀释为150u/l、100u/l、50u/l、25u/l、12.5u/l，按本法操作，结果如下表一：
2.2 方法比较
选择检测生化常规标本90份，分别用本法(y)和日本东芝TDA40FA全自动生化分析仪紫外酶偶联速率法(x)用上海久强试剂盒测定血清ALT，两法系数为r=0.991，y=1.072x＋1.032。
2.3 精密度
取2份低值、高值质控标本，批内重复测定20次，低值标本 -X=51u/l，SD＝1.1，CV＝2.1％；高值标本 X＝103u/l，SD＝2.0，CV＝1.94％。批间重复，将标本存4℃冰箱，每天重复测定4次，共测定20次，低值标本- X=51u/l，SD＝1.5，CV＝2.9％；高值标本 - X＝103u/l，SD＝2.9，CV＝2.8％，显示该方法的精密度和重复性较好。
2.4 反应稳定性
上述90份标本，在37℃反应10分钟后，进行3分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟、13分钟、15分钟、17分钟测定，发现3分钟、4分钟、6分钟测得的结果基本不变，8分钟以后值偏低，说明第二次显色结束，3分钟至6分钟内比色结果可靠。
2.5 酶反应试剂稳定性
酶反应试剂于4℃保存，可使用二周，酶活性测定结果不变。
2.6 干扰因素的消除
2.6.1 该法主波长为492nm，次波长为620nm，使用双波长可有效克服溶血、脂血的干扰[2]。
2.6.2 该法为获取反应10分钟与13分钟内两个时间点内的差值，可有效抵消溶血、脂血的影响。
3 结论
丙酮酸氧化酶速率法与紫外偶联速率法有很好的相关性，且仪器要求较低，大大降低了实验成本，非常适合血站大规模地检测献血员ALT。
结果表明至少在200u/l内呈线性。
参考文献
[1]吴敏、朱荐、何亚琴，快速全血生化分析仪用于ALT快速初筛的评价 《中国输血杂志》2004；17(1):27.
[2]刘玉振、陶玉生温涛等，双波长微孔板赖氏测法ALT含量 《中国输血杂志》2000；13(1):29-30.
目前，各级血液中心、血站常用的ALT检测方法有赖氏法、速率法、酮体粉法，但由于赖氏法(60min)反应时间较长，酮体粉法准确性差等特点，均不适用于基层血站大规模的无偿献血活动[1]。自2007年我站使用丙酮酸氧化酶速率法以来，收效良好，该方法使用基层血站必备的酶标仪即可，而且操作简单、快速，具有较高的精密度和准确性，有很好的重复性，非常适合基层血站大批量献血员ALT的控制。
1 材料和方法
1.1 仪器
酶标仪（Multiskan MK3，芬兰Labsystems公司产品），TDA40FA全自动生化分析仪（日本东芝公司产品）。
1.2 试剂
丙氨酸氨基转移酶ALT/GPT试剂盒，（北京倍肯恒业科技发展有限责任公司 ）
1.3 质控血清
由北京倍肯恒业科技发展有限责任公司提供，经全自动生化分析仪确认，低值血清(L)，51u/l，高值血清(H)，103u/l。
1.4 反应原理
L-丙氨酸＋α-酮戊二酸 丙酮酸＋L-谷氨酸
丙酮酸＋O2＋P H2O2＋乙酰磷酸
H2O2＋4-AAP＋TBHBA 红色醌类化合物
1.5 测定方法
取96孔酶标板上，A1孔为试剂空白、B1孔为标准，C1及D1孔为质控，A2~H12孔为测定。于A1孔内加蒸馏水20ul，于B1孔内加标准血清20ul；C1及D1孔分别加低值及高值质控血清20ul；A2~H12孔内分别加受检血清20ul，然后各孔加工作液200ul，混匀，置37℃反应10分钟时第一次比色吸光度为A1及13分钟时第二次比色吸光度为A2(即用双时测量模式即二点测量模式)，主波长为492nm，次波长为620nm，计算各孔吸光度之差值(A2-A1)。
计算：ALT活性(u/l)=测定孔吸光度／标准孔吸光度×标准血清(u/l)
2 实验结果与讨论
2.1 线性
取1份ALT活性200u/l的血清，用生理盐水稀释为150u/l、100u/l、50u/l、25u/l、12.5u/l，按本法操作，结果如下表一：
2.2 方法比较
选择检测生化常规标本90份，分别用本法(y)和日本东芝TDA40FA全自动生化分析仪紫外酶偶联速率法(x)用上海久强试剂盒测定血清ALT，两法系数为r=0.991，y=1.072x＋1.032。
2.3 精密度
取2份低值、高值质控标本，批内重复测定20次，低值标本 -X=51u/l，SD＝1.1，CV＝2.1％；高值标本 X＝103u/l，SD＝2.0，CV＝1.94％。批间重复，将标本存4℃冰箱，每天重复测定4次，共测定20次，低值标本- X=51u/l，SD＝1.5，CV＝2.9％；高值标本 - X＝103u/l，SD＝2.9，CV＝2.8％，显示该方法的精密度和重复性较好。
2.4 反应稳定性
上述90份标本，在37℃反应10分钟后，进行3分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟、13分钟、15分钟、17分钟测定，发现3分钟、4分钟、6分钟测得的结果基本不变，8分钟以后值偏低，说明第二次显色结束，3分钟至6分钟内比色结果可靠。
2.5 酶反应试剂稳定性
酶反应试剂于4℃保存，可使用二周，酶活性测定结果不变。
2.6 干扰因素的消除
2.6.1 该法主波长为492nm，次波长为620nm，使用双波长可有效克服溶血、脂血的干扰[2]。
2.6.2 该法为获取反应10分钟与13分钟内两个时间点内的差值，可有效抵消溶血、脂血的影响。
3 结论
丙酮酸氧化酶速率法与紫外偶联速率法有很好的相关性，且仪器要求较低，大大降低了实验成本，非常适合血站大规模地检测献血员ALT。
结果表明至少在200u/l内呈线性。
参考文献
[1]吴敏、朱荐、何亚琴，快速全血生化分析仪用于ALT快速初筛的评价 《中国输血杂志》2004；17(1):27.
[2]刘玉振、陶玉生温涛等，双波长微孔板赖氏测法ALT含量 《中国输血杂志》2000；13(1):29-30.