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摘 要 研究吲哚丁酸的体外抗氧化活性，包括DPPH自由基、羟基自由基和过氧化氢的清除能力，以及金属螯合活性和还原力。结果表明，吲哚丁酸具有显著的抗氧化活性，且与吲哚乙酸相当，其对DPPH自由基和羟自由基清除作用、螯合力、还原能力均高于萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸，而对Fe2+的络合能力与没食子酸无显著差异。
关键词 吲哚丁酸；抗氧化；自由基
中图分类号 Q946；Q945 文献标识码 A
Antioxidant Activity of Indole-3-butyric Acid
SHEN Yan1， 2， CHEN Weijun4， ZHANG Tao3 ， JIANG Xuefei1， 2
LI Xinguo1， 2 *， LI Shaopeng1， 2， SONG Xiqiang1， 2
1 Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of
Education， Haikou， Hainan 570228， China
2 College of Horticulture and Landscape， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
3 College of Food Science and Technique， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
4 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China
Abstract The antioxidant activity of indole-3-butyric acid was studied by measuring the DPPH scavenging activity， hydroxyl radical scavenging activity， hydrogen peroxide scavenging activity， metal chelating activity and reducing power. The results showed that both IBA and IAA expressed a stronger antioxidant activity than NAA and 2，4-D in the DPPH scavenging activity， hydroxyl radical scavenging activity， metal chelating activity， reducing power. Compared with GA， no significant difference in metal chelating activity was appeared.
Key words Indole-3-butyric acid； Antioxidant； Free radical
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.019
吲哚（Indole）是吡咯和苯并联的化合物，分子内含有亚胺基，许多具有抗癌[1]、抗氧化[2]、抗病毒[3]药理功能的物质都来源于吲哚类衍生物，通常由吲哚环作为基础结构合成。近年来，吲哚类衍生物的生理活性和其活性机理被大量地研究和开发[4]，其中最受青睐的就是这类物质的抗氧化作用。吲哚类衍生物可以通过清除自由基从而阻止糖类和脂质发生氧化，其清除能力主要是由吲哚环上的氮原子提供，被称作是吲哚类衍生物的“活性还原中心”[5-7]。
吲哚丁酸（Indole-3-butyric acid，IBA）作为一类含有吲哚环结构的植物激素，能够抑制根的伸长生长，进而促进侧根原基的发生，在根的顶端优势的调控中起着十分重要的作用[8-10]；但是目前对其促进生根的机理研究仍不明确。由于吲哚类衍生物本身具有的潜在的抗氧化作用，因此，吲哚丁酸可能是通过其抗氧化作用调控植物体内的氧化还原平衡，从而达到对植物体氧化胁迫的保护作用。为了验证这一猜测，笔者研究了IBA体外对DPPH自由基、羟基自由基、过氧化氢的清除能力，以及对二价铁离子的络合能力，并同其他的激素做了比较，以期为后续的研究提供科学基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 主要仪器 UV-1200紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；SL-N型分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；PYX-DHG-9101型电热恒温鼓风干燥箱（广东韶关科力实验仪器有限公司）；HH-6型数显恒温水浴锅（上海康仪有限公司）；CQ-10超声波清洗器（宁波海瞩五方超声设备有限公司）；Heraeus Multifuge XIR高速离心机（Thermo scientific）。
1.1.2 主要试剂 2-脱氧核糖、抗坏血酸、DPPH、Ferrozine铁试剂、硫代巴比妥酸、铁氰化钾皆购于美国SIGMA公司；其他药品均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 DPPH自由基清除试验 依据Blois方法测定DPPH自由基清除能力[11]。将2 mL 4 mmol/L的不同样品溶液加入到2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中。置于避光条件下反应30 min后，测定各混合溶液在517 nm处的光吸收值，较低的吸收值意味着高效的DPPH自由基清除能力。 DPPH自由基的清除率=（1-A样品/A模型）×100%
1.2.2 还原能力的测定 根据Oyaizur的方法[12]，并进行改进。移取1 mL 1 mmol/L的各样品溶液于试管中，加入2.5 mL 0.2 mol/L，pH6.6的磷酸缓冲液和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，混合后于50 ℃水浴20 min后，再加入10%三氯乙酸1 mL，3 500 r/min常温离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，混匀后在700 nm处比色。
1.2.3 羟基自由基的清除试验 根据Elizabeth方法[13]，略加改进。在225 μL 0.1 mmol/L，pH7.4磷酸缓冲液中加入10 mmol/L脱氧核糖溶液125 μL，10 mmol/L过氧化氢溶液50 μL，25 μL 10 mmol/L的三氯化铁溶液，10 mmol/L EDTA溶液25 μL和4 mmol/L的样品溶液0.1 mL。通过添加0.03 mL 10 mmol/L的抗坏血酸引发反应，37 ℃水浴1 h，加入1%硫代巴比妥酸0.25 mL和2.8%三氯乙酸0.25 mL。90 ℃下水浴15 min，冷却后在532 nm处测光吸收值。
羟基自由基的清除率=（1-A样品/A模型）×100%
1.2.4 清除过氧化氢能力试验 根据Wettasinghe方法[14]。用磷酸缓冲液（pH7.4）配制43 mmol/L的过氧化氢溶液。使其在230 nm处的摩尔吸收系数为81 mol/（L·cm）。取1 mL 1 mmol/L不同样品溶液加入到2 mL过氧化氢溶液中。反应10 min后测定其在230 nm的光吸收值，以不含过氧化氢溶液的试样作为对照组。
1.2.5 Fe2+络合能力测定 参考Yen Gow-Chin方法[15]。移取2 mL 0.4 mmol/L样品于试管中，加入1 mmol/L FeSO4溶液0.4 mL和5 mmol/L的Ferrozine铁试剂溶液0.8 mL，室温下反应10 min后，再加入1 mL无水乙醇。在562 nm处测吸光率。
Fe2+络合率=（1-A样品-A模型）×100%
1.3 数据统计分析
所有数据用SPSS20软件处理，差异显著性水平为α=0.05，多重比较使用单因素方差分析（ANOVA）。
2 结果与分析
2.1 DPPH自由基清除作用
DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，在517 nm波长处有最大吸收，通过此波长下吸光值的减少可表征抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力[16]。由图1可知，5种样品清除DPPH自由基的活性，其中GA、IAA和IBA表现出显著清除DPPH自由基的能力，清除率分别为95.51%、45.42%和28.67%。虽然IAA和IBA的DPPH自由基清除活性均显著低于GA，但均显著高于2，4-D（6.34%）和NAA（8.43%），同时2，4-D和NAA两者对DPPH的清除率之间差异不明显（p>0.05）。
2.2 还原力的测定
还原力的大小是评判分子抗氧化能力的主要指标之一。图2显示的5个样品的还原能力，较高的吸光度显示较强的还原能力。GA和IBA、NAA的乙醇溶液测定有较高的还原力，它们之间表现出显著的差异（p<0.01）。IBA吸光值为0.280，还原能力居中，与IAA无显著差异。
2.3 测定羟基自由基的清除作用
通过抑制脱氧核糖降解测定样品对羟基自由基的清除活性，过氧化氢和Fe2+反应形成羟基自由基，随后攻击脱氧核糖导致其降解为一系列片段脱氧核糖。一些或所有的脱氧核糖片段，在较低的pH值下与硫代巴比妥酸反应形成粉红色的物质。从图3可知，IBA的清除率为91.33%，是几个样品中羟基自由基的清除活性最高值，其次是IAA，二者间差异并不显著。GA的清除率最低。
2.4 过氧化氢的清除作用
过氧化氢具有穿透生物膜的能力，同时在其他自由基形成过程中作为一个中介生产更多的活性氧分子。从图4可以看出，IBA具有很强的清除过氧化氢的能力，清除率高达93.29%，其次是GA和IAA，NAA的清除能力则最小。
2.5 金属Fe2+络合活性的测定
金属离子在自由基产生过程中起着重要作用，抗氧化剂通过络合金属离子而减少活性氧自由基的产生。从图5可以看出，5种物质的金属络合活性不强，其中NAA和2，4-D基本没有络合活性，对Fe2+的络合率分别为2.18%和2.51%。而IAA、IBA和GA虽然表现出相对较强的络合作用，但是仍低于10%；此外IBA（8.21%）和GA（8.37%）之间无显著差异性（p>0.05）。
3 讨论与结论
笔者采用不同的自由基体系研究了IBA分子本身的抗氧化能力。天然产物抗氧化分子机理主要有H转移机制[17-18]、电子转移机制[19-21]和金属络合机制[22-23]。本研究对于DPPH自由基、羟基自由基、过氧化氢的清除活性评价主要是从H转移机制方面考虑，还原力和络合能力则分别是从电子转移机制和金属络合机制方面研究IBA可能具有的抗氧化活性。从以上结果可以看出，在活性氧清除方面，IBA对于DPPH自由基、羟基自由基、过氧化物的清除能力较为突出，明显高于NAA和2，4-D。IAA在DPPH自由基和过氧化氢清除能力方面略高于IBA，这主要是由于其分子中的烷基链影响的结果。众多的研究证明烷基链的长短对其分子的抗氧化有较大影响，主要原因是通过改善分子的电子布局和疏水性实现的[24]。对还原力和金属络合作用的研究发现IBA和IAA活性间差异不显著，这也说明其烷基链对它们的影响不明显。 GA的抗氧化活性已被系统研究[25]，它常用来做评价其他天然产物活性大小的标准品之一[26-28]。本研究的结果可以看出，在活性氧清除和络合能力方面，IBA的能力均略高或接近于GA，而在还原力方面低于GA。GA的抗氧化机制已经确认为其分子中的羟基进行H转移所致[29]。由此可以判断，IBA的抗氧化活性机制与H转移和络合有关。酸类抗氧化剂的金属络合主要和它的临位羟基和羰基有关[30]，因此可以推测IBA对金属的络合主要是通过羰基实现的，但关于IBA的H转移发生的具体位点目前还不清楚，一般认为可能会来源于与-NH中的H，也有可能来自-COOH的氢，具体的发生位点尚需下一步的研究。
参考文献
[1] Chen I， Safe S， Bjeldanes L. Indole-3-carbinol and diindolylmethane as aryl hydrocarbon（Ah）receptor agonists and antagonists in T47D human breast cancer cells[J]. Biochemical Pharmacology， 1996， 51（8）： 1 069-1 076.
[2] Suzen S， Buyukbingol E. Anti-cancer activity studies of indolalthio-
hydantoin（PIT）on certain cancer cell lines[J]. Il Farmaco， 2000， 55（4）： 246-248.
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责任编辑：沈德发
关键词 吲哚丁酸；抗氧化；自由基
中图分类号 Q946；Q945 文献标识码 A
Antioxidant Activity of Indole-3-butyric Acid
SHEN Yan1， 2， CHEN Weijun4， ZHANG Tao3 ， JIANG Xuefei1， 2
LI Xinguo1， 2 *， LI Shaopeng1， 2， SONG Xiqiang1， 2
1 Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of
Education， Haikou， Hainan 570228， China
2 College of Horticulture and Landscape， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
3 College of Food Science and Technique， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
4 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China
Abstract The antioxidant activity of indole-3-butyric acid was studied by measuring the DPPH scavenging activity， hydroxyl radical scavenging activity， hydrogen peroxide scavenging activity， metal chelating activity and reducing power. The results showed that both IBA and IAA expressed a stronger antioxidant activity than NAA and 2，4-D in the DPPH scavenging activity， hydroxyl radical scavenging activity， metal chelating activity， reducing power. Compared with GA， no significant difference in metal chelating activity was appeared.
Key words Indole-3-butyric acid； Antioxidant； Free radical
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.019
吲哚（Indole）是吡咯和苯并联的化合物，分子内含有亚胺基，许多具有抗癌[1]、抗氧化[2]、抗病毒[3]药理功能的物质都来源于吲哚类衍生物，通常由吲哚环作为基础结构合成。近年来，吲哚类衍生物的生理活性和其活性机理被大量地研究和开发[4]，其中最受青睐的就是这类物质的抗氧化作用。吲哚类衍生物可以通过清除自由基从而阻止糖类和脂质发生氧化，其清除能力主要是由吲哚环上的氮原子提供，被称作是吲哚类衍生物的“活性还原中心”[5-7]。
吲哚丁酸（Indole-3-butyric acid，IBA）作为一类含有吲哚环结构的植物激素，能够抑制根的伸长生长，进而促进侧根原基的发生，在根的顶端优势的调控中起着十分重要的作用[8-10]；但是目前对其促进生根的机理研究仍不明确。由于吲哚类衍生物本身具有的潜在的抗氧化作用，因此，吲哚丁酸可能是通过其抗氧化作用调控植物体内的氧化还原平衡，从而达到对植物体氧化胁迫的保护作用。为了验证这一猜测，笔者研究了IBA体外对DPPH自由基、羟基自由基、过氧化氢的清除能力，以及对二价铁离子的络合能力，并同其他的激素做了比较，以期为后续的研究提供科学基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 主要仪器 UV-1200紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；SL-N型分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；PYX-DHG-9101型电热恒温鼓风干燥箱（广东韶关科力实验仪器有限公司）；HH-6型数显恒温水浴锅（上海康仪有限公司）；CQ-10超声波清洗器（宁波海瞩五方超声设备有限公司）；Heraeus Multifuge XIR高速离心机（Thermo scientific）。
1.1.2 主要试剂 2-脱氧核糖、抗坏血酸、DPPH、Ferrozine铁试剂、硫代巴比妥酸、铁氰化钾皆购于美国SIGMA公司；其他药品均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 DPPH自由基清除试验 依据Blois方法测定DPPH自由基清除能力[11]。将2 mL 4 mmol/L的不同样品溶液加入到2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中。置于避光条件下反应30 min后，测定各混合溶液在517 nm处的光吸收值，较低的吸收值意味着高效的DPPH自由基清除能力。 DPPH自由基的清除率=（1-A样品/A模型）×100%
1.2.2 还原能力的测定 根据Oyaizur的方法[12]，并进行改进。移取1 mL 1 mmol/L的各样品溶液于试管中，加入2.5 mL 0.2 mol/L，pH6.6的磷酸缓冲液和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，混合后于50 ℃水浴20 min后，再加入10%三氯乙酸1 mL，3 500 r/min常温离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，混匀后在700 nm处比色。
1.2.3 羟基自由基的清除试验 根据Elizabeth方法[13]，略加改进。在225 μL 0.1 mmol/L，pH7.4磷酸缓冲液中加入10 mmol/L脱氧核糖溶液125 μL，10 mmol/L过氧化氢溶液50 μL，25 μL 10 mmol/L的三氯化铁溶液，10 mmol/L EDTA溶液25 μL和4 mmol/L的样品溶液0.1 mL。通过添加0.03 mL 10 mmol/L的抗坏血酸引发反应，37 ℃水浴1 h，加入1%硫代巴比妥酸0.25 mL和2.8%三氯乙酸0.25 mL。90 ℃下水浴15 min，冷却后在532 nm处测光吸收值。
羟基自由基的清除率=（1-A样品/A模型）×100%
1.2.4 清除过氧化氢能力试验 根据Wettasinghe方法[14]。用磷酸缓冲液（pH7.4）配制43 mmol/L的过氧化氢溶液。使其在230 nm处的摩尔吸收系数为81 mol/（L·cm）。取1 mL 1 mmol/L不同样品溶液加入到2 mL过氧化氢溶液中。反应10 min后测定其在230 nm的光吸收值，以不含过氧化氢溶液的试样作为对照组。
1.2.5 Fe2+络合能力测定 参考Yen Gow-Chin方法[15]。移取2 mL 0.4 mmol/L样品于试管中，加入1 mmol/L FeSO4溶液0.4 mL和5 mmol/L的Ferrozine铁试剂溶液0.8 mL，室温下反应10 min后，再加入1 mL无水乙醇。在562 nm处测吸光率。
Fe2+络合率=（1-A样品-A模型）×100%
1.3 数据统计分析
所有数据用SPSS20软件处理，差异显著性水平为α=0.05，多重比较使用单因素方差分析（ANOVA）。
2 结果与分析
2.1 DPPH自由基清除作用
DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，在517 nm波长处有最大吸收，通过此波长下吸光值的减少可表征抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力[16]。由图1可知，5种样品清除DPPH自由基的活性，其中GA、IAA和IBA表现出显著清除DPPH自由基的能力，清除率分别为95.51%、45.42%和28.67%。虽然IAA和IBA的DPPH自由基清除活性均显著低于GA，但均显著高于2，4-D（6.34%）和NAA（8.43%），同时2，4-D和NAA两者对DPPH的清除率之间差异不明显（p>0.05）。
2.2 还原力的测定
还原力的大小是评判分子抗氧化能力的主要指标之一。图2显示的5个样品的还原能力，较高的吸光度显示较强的还原能力。GA和IBA、NAA的乙醇溶液测定有较高的还原力，它们之间表现出显著的差异（p<0.01）。IBA吸光值为0.280，还原能力居中，与IAA无显著差异。
2.3 测定羟基自由基的清除作用
通过抑制脱氧核糖降解测定样品对羟基自由基的清除活性，过氧化氢和Fe2+反应形成羟基自由基，随后攻击脱氧核糖导致其降解为一系列片段脱氧核糖。一些或所有的脱氧核糖片段，在较低的pH值下与硫代巴比妥酸反应形成粉红色的物质。从图3可知，IBA的清除率为91.33%，是几个样品中羟基自由基的清除活性最高值，其次是IAA，二者间差异并不显著。GA的清除率最低。
2.4 过氧化氢的清除作用
过氧化氢具有穿透生物膜的能力，同时在其他自由基形成过程中作为一个中介生产更多的活性氧分子。从图4可以看出，IBA具有很强的清除过氧化氢的能力，清除率高达93.29%，其次是GA和IAA，NAA的清除能力则最小。
2.5 金属Fe2+络合活性的测定
金属离子在自由基产生过程中起着重要作用，抗氧化剂通过络合金属离子而减少活性氧自由基的产生。从图5可以看出，5种物质的金属络合活性不强，其中NAA和2，4-D基本没有络合活性，对Fe2+的络合率分别为2.18%和2.51%。而IAA、IBA和GA虽然表现出相对较强的络合作用，但是仍低于10%；此外IBA（8.21%）和GA（8.37%）之间无显著差异性（p>0.05）。
3 讨论与结论
笔者采用不同的自由基体系研究了IBA分子本身的抗氧化能力。天然产物抗氧化分子机理主要有H转移机制[17-18]、电子转移机制[19-21]和金属络合机制[22-23]。本研究对于DPPH自由基、羟基自由基、过氧化氢的清除活性评价主要是从H转移机制方面考虑，还原力和络合能力则分别是从电子转移机制和金属络合机制方面研究IBA可能具有的抗氧化活性。从以上结果可以看出，在活性氧清除方面，IBA对于DPPH自由基、羟基自由基、过氧化物的清除能力较为突出，明显高于NAA和2，4-D。IAA在DPPH自由基和过氧化氢清除能力方面略高于IBA，这主要是由于其分子中的烷基链影响的结果。众多的研究证明烷基链的长短对其分子的抗氧化有较大影响，主要原因是通过改善分子的电子布局和疏水性实现的[24]。对还原力和金属络合作用的研究发现IBA和IAA活性间差异不显著，这也说明其烷基链对它们的影响不明显。 GA的抗氧化活性已被系统研究[25]，它常用来做评价其他天然产物活性大小的标准品之一[26-28]。本研究的结果可以看出，在活性氧清除和络合能力方面，IBA的能力均略高或接近于GA，而在还原力方面低于GA。GA的抗氧化机制已经确认为其分子中的羟基进行H转移所致[29]。由此可以判断，IBA的抗氧化活性机制与H转移和络合有关。酸类抗氧化剂的金属络合主要和它的临位羟基和羰基有关[30]，因此可以推测IBA对金属的络合主要是通过羰基实现的，但关于IBA的H转移发生的具体位点目前还不清楚，一般认为可能会来源于与-NH中的H，也有可能来自-COOH的氢，具体的发生位点尚需下一步的研究。
参考文献
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