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摘 要：目的：观察ZEB1、ZEB2及miR-200a在上皮性卵巢癌I期患者中的表达，分析其表达水平与组织学的关系。方法：收集120例上皮性卵巢癌I期患者作为病例组，120例卵巢上皮性良性肿瘤患者作为对照组，120例因子宫因素切除子宫及双附件的患者作为空白组，观察ZEB1、ZEB2及miR-200a在不同组的表达。同时研究在上皮性卵巢癌I期患者的不同组织学分型中以上指标的表达特点。结果：病例组中ZEB1阳性率显著高于对照组和空白组（P<0.5），病例组ZEB2阳性率与对照组、空白组无统计学显著性差异（P>0.5），病例组miR-200a较对照组、空白组显著上调（P<0.5）。miR-200a在透明细胞癌的上调率显著高于粘液性囊腺癌、浆液性囊腺癌、子宫内膜癌（P<0.05）。结论：本研究提示在早期上皮性卵巢癌，miR-200a可能作为诊断指标；尤其对于透明细胞癌敏感度较高。而ZEB家族因其表达的时段性，在临床上的应用仍有待发掘。
关键词：ZEB家族，miR-200家族，上皮性卵巢癌
Abstract： Objective： To observe expressions of ZEB1， ZEB2 and miR-200a in epithelial ovarian cancer patients of phase I， and analyze their characteristics in histology. Methods： Set 120 cases of epithelial ovarian cancer of Phase I as the case group， 120 cases of patients with epithelial ovarian benign tumor as a control group， and 120 cases of patients accepted oophorectomy due to uterine factors as a blank group. Towards the study we supposed to obverse expressions of ZEB1， ZEB2 and miR -200a in different groups，also to study the characteristics of expressions in different histological type. Results： The positive rate of ZEB1 in case group significantly higer than others（P <0.5）.While the positive rate of ZEB2 seen no significant difference in those three groups（P> 0.5）.The rate of miR-200a up-regulation in case group was significantly higher （P <0.5）compared with the control group and blank group .The rate of miR-200a up-regulation in clear cell carcinoma was significantly higher than mucinous adenocarcinoma， serous adenocarcinoma and endometrial cancer （P <0.05）. Conclusion： This study suggests that in the early epithelial ovarian cancer， miR-200a may be used as a diagnostic indicator，especially for clear cell carcinoma. The expressions of ZEB family was changing in different stage，so the clinical application remains to be discovered.
Keywords： ZEB family， miR-200 family， epithelial ovarian cancer
卵巢恶性上皮肿瘤是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。因卵巢的解剖特点，早期病变不易发现，大部分患者经诊断已属晚期。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在卵巢恶性上皮肿瘤的发生和侵袭转移的进程中起关键作用，此外EMT还与食管癌、口腔癌、乳腺癌、鼻咽癌、直肠癌等上皮性来源的恶性肿瘤的原位浸润和远处转移有关[1]。EMT的发生由一系列蛋白、信号通路、转录因子、生长因子等调控，E-钙粘蛋白（E-cadherin）的下降被视为EMT发生的标志，而ZEB家族及miR-200家族参与其中[2-4]。有研究发现ZEB1、ZEB2的基因表达与miR-200的表达在EMT中相互抑制，形成双重负反馈调节环[5]。本研究旨在观察ZEB1、ZEB2及miR-200a在上皮性卵巢癌Ⅰ期患者中的表达，为寻求早期诊断上皮性卵巢癌的临床指标提供依据。
1资料与方法
1.1研究对象
收集2012年1月至2014年6月在广州医学院第一附属医院、第二附属医院、中山大学附属第一医院、广州华侨医院等医院收治的120例卵巢癌Ⅰ期患者作为病例组。所有入组患者需符合以下标准：①均经手术切除且病理证实为上皮性卵巢癌Ⅰ期；②术前未经放、化疗③术前未服用激素类药物④无其他系统严重疾病。
按配对原则从同期120例良性卵巢上皮性肿瘤患者中抽取与病例组同民族、同性别、年龄差别小于5岁、无血缘关系的对象为对照组。所有入组患者需符合以下标准：①均经手术切除且病理证实为良性上皮性卵巢肿瘤②术前未经特殊治疗③无其他系统严重疾病。 同法按配对原则抽取因子宫肌瘤切除子宫及双附件的病例设立空白组，入组者均无其他系统严重疾病，近一月无用药史。
1.2主要试剂
TRIzol试剂盒、real-time qPCR、ZEB1多克隆抗体、ZEB2多克隆抗体、免疫组化试剂盒及显色试剂盒。
1.3实验方法
miR-200a的测定：组 织 和 细 胞 总 RNA提 取 按TRIzol 说 明 书 进行。RNA 经1% 琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行质量控制及确定浓度。芯片杂交及数据处理由上海伯豪生物技术有限公司完成。每个标本取3 对 上皮性卵巢癌 及 其 癌 旁 组织， 抽 提 总RNA 并 在miRNA 芯 片 上 进 行 杂 交 反应。microRNA芯 片 检 测 实 验 对 于 分 子 表达 变 化 的 判 断 标 准 是 将 校 正 后 的卵巢 癌 样 品 与 癌旁正 常组织样品 间杂交信号 强度的比值（T/N）>2为上调，<0.5为下调。
ZEB1、ZEB2的测定：按试剂盒说明书操作。以磷酸盐缓冲液代替一抗作空白对照。切片常规脱蜡，PH9.0 EDTA微波炉加热修复抗原，3%双氧水37℃孵育15min灭活内源性过氧化物酶，正常山羊或兔血清工作液封闭30min，加ZEB1及ZEB2一抗（稀释度均为1：100）。4℃湿盒中过夜；复温1小时，加生物素化二抗37℃孵育30min，以辣根过氧化物酶标记链酶卵白素37℃孵育30min，加DAB显微镜下显色，苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，碳酸锂返蓝，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。结果判定：ZEB-1和ZEB-2阳性结果判定：核阳性着色的肿瘤细胞和非间质细胞计为阳性细胞，按着色度积分：无0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；≥1分计为阳性，<1分计为阴性[6]。
1.4统计学方法
使用SPSS19.0软件进行统计，数据结果进行卡方检验，使用连续性校正公式或Fisher精确检验计算χ2值，检验水准α=0.05。
2结果
表1 ZEB1、ZEB2、miR-200a的表达
*与对照组比较，差异有显著性意义（P<0.05）
#与空白组比较，差异有显著性意义（P<0.05）
表2 上皮性卵巢癌的不同组织学分型中ZEB1、ZEB2、miR-200a的表达
ZEB1、ZEB2的阳性率组间比较无显著性差异（P>0.5）。miR-200a在透明细胞癌上调率显著高于余组（P<0.05），提示在透明细胞癌中miR-200a可能存在异常高表达。
3讨论
卵巢癌因发病隐匿，早期诊断较困难，常用的指标为血清CA-125，但其只在不到50%的早期患者中能检测到，且妊娠、月经期、子宫内膜炎等可干扰其结果[7]。因此寻求新的肿瘤标志物用于卵巢癌早期的诊断、疗效判定显得必要。
正常卵巢上皮为间皮表型，内源性ZEB1、ZEB2高表达。癌变早期ZEB蛋白表达受抑制。腹腔转移初期，上皮性卵巢癌发生EMT，ZEB1、ZEB2重新升高。miR-200家族可直接靶向抑制ZEB1/ZEB2，其中miR-200a可通过下调ZEB2而抑制卵巢癌干细胞的侵袭和转移[8-9]。本研究发现在病例组中ZEB1阳性率显著高于对照组和空白组（P<0.5），病例组ZEB2阳性率与对照组、空白组无统计学显著性差异（P>0.5），病例组miR-200a较对照组、空白组显著上调（P<0.5）。提示在上皮性卵巢癌I期存在miR-200的高表达，其抑制肿瘤的侵袭和转移。ZEB1的高表达与文献报道相符合，而ZEB2的表达与对照组和空白组无统计学显著性差异。本研究提示在上皮性卵巢癌I期，miR-200a可能作为诊断指标；尤其对于透明细胞癌可能敏感度较高。而ZEB家族因其表达的时段性，在临床上的应用仍有待发掘。
参考文献：
[1]Von Burstin J，Eser S，Paul MC，et al.E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex[J].Gastroenterology，2009，137（1）：361-371.
[2]Haslehurst AM， Koti M， Dharsee M， et al.EMT transcription factors snail and slug directly contribute to cisplatin resistance in ovarian cancer[J]. BMC Cancer，2012，12：91.
[3]Vergare D，Merlot B，Lucot JP，et al. Epithelial-mesenchymal transition in ovarian cancer[J].Cancer Lett，2010，291（1）：59-66.
[4]Park SM，Gaur AB，Lengyel E，et al.The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2.Genes Dev，2008，22（7）：894-907.
[5]Bracken CP，Gregory PA，Kolesnikoff N，et al.A double-negative feedback loop between ZEB1-SIP1 and the microRNA-200 family regulates epithelial-mesenchymal transition[J].Cancer Res，2008，68（19）7846-7854.
[6]Liu Z，Sun B，Qi L，et a1.Zinc finger E-box binding homeobox 1 promotes vasculogenic mimicry in colorectal cancer through induction of epithelial-to-mesenchymal transition.Cancer Sci，2012，103（4）：813—820.
[7]DodgeJE，CovensAL，LacchettiC，et a1.Preoperative identificationOf a suspjcious adnexal mass：Asystematic review and meta-analysis.Gyneco1 0ncol，2012，126：157-166.
[8]Korpal M，Lee ES，Hu G，et a1.The miR-200 family inhibits epithelial-mesenchymal-transition and cancer cell migration by directTargeting of E-cadhefin transcriptional repressors ZEBl and ZEB2[J].J Biol Chem，2008，283（22）：14910—14914.
[9]Wu Q，Guo R，Lin M，et a1.MicroRNA-200a inhibits CDl33/1+ ovarian cancer stem cells migration and invasion by targeting E-cadherinrepressor ZEB2[J].Gynecol Oncol，2011，122（1）：149-154.
关键词：ZEB家族，miR-200家族，上皮性卵巢癌
Abstract： Objective： To observe expressions of ZEB1， ZEB2 and miR-200a in epithelial ovarian cancer patients of phase I， and analyze their characteristics in histology. Methods： Set 120 cases of epithelial ovarian cancer of Phase I as the case group， 120 cases of patients with epithelial ovarian benign tumor as a control group， and 120 cases of patients accepted oophorectomy due to uterine factors as a blank group. Towards the study we supposed to obverse expressions of ZEB1， ZEB2 and miR -200a in different groups，also to study the characteristics of expressions in different histological type. Results： The positive rate of ZEB1 in case group significantly higer than others（P <0.5）.While the positive rate of ZEB2 seen no significant difference in those three groups（P> 0.5）.The rate of miR-200a up-regulation in case group was significantly higher （P <0.5）compared with the control group and blank group .The rate of miR-200a up-regulation in clear cell carcinoma was significantly higher than mucinous adenocarcinoma， serous adenocarcinoma and endometrial cancer （P <0.05）. Conclusion： This study suggests that in the early epithelial ovarian cancer， miR-200a may be used as a diagnostic indicator，especially for clear cell carcinoma. The expressions of ZEB family was changing in different stage，so the clinical application remains to be discovered.
Keywords： ZEB family， miR-200 family， epithelial ovarian cancer
卵巢恶性上皮肿瘤是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。因卵巢的解剖特点，早期病变不易发现，大部分患者经诊断已属晚期。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在卵巢恶性上皮肿瘤的发生和侵袭转移的进程中起关键作用，此外EMT还与食管癌、口腔癌、乳腺癌、鼻咽癌、直肠癌等上皮性来源的恶性肿瘤的原位浸润和远处转移有关[1]。EMT的发生由一系列蛋白、信号通路、转录因子、生长因子等调控，E-钙粘蛋白（E-cadherin）的下降被视为EMT发生的标志，而ZEB家族及miR-200家族参与其中[2-4]。有研究发现ZEB1、ZEB2的基因表达与miR-200的表达在EMT中相互抑制，形成双重负反馈调节环[5]。本研究旨在观察ZEB1、ZEB2及miR-200a在上皮性卵巢癌Ⅰ期患者中的表达，为寻求早期诊断上皮性卵巢癌的临床指标提供依据。
1资料与方法
1.1研究对象
收集2012年1月至2014年6月在广州医学院第一附属医院、第二附属医院、中山大学附属第一医院、广州华侨医院等医院收治的120例卵巢癌Ⅰ期患者作为病例组。所有入组患者需符合以下标准：①均经手术切除且病理证实为上皮性卵巢癌Ⅰ期；②术前未经放、化疗③术前未服用激素类药物④无其他系统严重疾病。
按配对原则从同期120例良性卵巢上皮性肿瘤患者中抽取与病例组同民族、同性别、年龄差别小于5岁、无血缘关系的对象为对照组。所有入组患者需符合以下标准：①均经手术切除且病理证实为良性上皮性卵巢肿瘤②术前未经特殊治疗③无其他系统严重疾病。 同法按配对原则抽取因子宫肌瘤切除子宫及双附件的病例设立空白组，入组者均无其他系统严重疾病，近一月无用药史。
1.2主要试剂
TRIzol试剂盒、real-time qPCR、ZEB1多克隆抗体、ZEB2多克隆抗体、免疫组化试剂盒及显色试剂盒。
1.3实验方法
miR-200a的测定：组 织 和 细 胞 总 RNA提 取 按TRIzol 说 明 书 进行。RNA 经1% 琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行质量控制及确定浓度。芯片杂交及数据处理由上海伯豪生物技术有限公司完成。每个标本取3 对 上皮性卵巢癌 及 其 癌 旁 组织， 抽 提 总RNA 并 在miRNA 芯 片 上 进 行 杂 交 反应。microRNA芯 片 检 测 实 验 对 于 分 子 表达 变 化 的 判 断 标 准 是 将 校 正 后 的卵巢 癌 样 品 与 癌旁正 常组织样品 间杂交信号 强度的比值（T/N）>2为上调，<0.5为下调。
ZEB1、ZEB2的测定：按试剂盒说明书操作。以磷酸盐缓冲液代替一抗作空白对照。切片常规脱蜡，PH9.0 EDTA微波炉加热修复抗原，3%双氧水37℃孵育15min灭活内源性过氧化物酶，正常山羊或兔血清工作液封闭30min，加ZEB1及ZEB2一抗（稀释度均为1：100）。4℃湿盒中过夜；复温1小时，加生物素化二抗37℃孵育30min，以辣根过氧化物酶标记链酶卵白素37℃孵育30min，加DAB显微镜下显色，苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，碳酸锂返蓝，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。结果判定：ZEB-1和ZEB-2阳性结果判定：核阳性着色的肿瘤细胞和非间质细胞计为阳性细胞，按着色度积分：无0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；≥1分计为阳性，<1分计为阴性[6]。
1.4统计学方法
使用SPSS19.0软件进行统计，数据结果进行卡方检验，使用连续性校正公式或Fisher精确检验计算χ2值，检验水准α=0.05。
2结果
表1 ZEB1、ZEB2、miR-200a的表达
*与对照组比较，差异有显著性意义（P<0.05）
#与空白组比较，差异有显著性意义（P<0.05）
表2 上皮性卵巢癌的不同组织学分型中ZEB1、ZEB2、miR-200a的表达
ZEB1、ZEB2的阳性率组间比较无显著性差异（P>0.5）。miR-200a在透明细胞癌上调率显著高于余组（P<0.05），提示在透明细胞癌中miR-200a可能存在异常高表达。
3讨论
卵巢癌因发病隐匿，早期诊断较困难，常用的指标为血清CA-125，但其只在不到50%的早期患者中能检测到，且妊娠、月经期、子宫内膜炎等可干扰其结果[7]。因此寻求新的肿瘤标志物用于卵巢癌早期的诊断、疗效判定显得必要。
正常卵巢上皮为间皮表型，内源性ZEB1、ZEB2高表达。癌变早期ZEB蛋白表达受抑制。腹腔转移初期，上皮性卵巢癌发生EMT，ZEB1、ZEB2重新升高。miR-200家族可直接靶向抑制ZEB1/ZEB2，其中miR-200a可通过下调ZEB2而抑制卵巢癌干细胞的侵袭和转移[8-9]。本研究发现在病例组中ZEB1阳性率显著高于对照组和空白组（P<0.5），病例组ZEB2阳性率与对照组、空白组无统计学显著性差异（P>0.5），病例组miR-200a较对照组、空白组显著上调（P<0.5）。提示在上皮性卵巢癌I期存在miR-200的高表达，其抑制肿瘤的侵袭和转移。ZEB1的高表达与文献报道相符合，而ZEB2的表达与对照组和空白组无统计学显著性差异。本研究提示在上皮性卵巢癌I期，miR-200a可能作为诊断指标；尤其对于透明细胞癌可能敏感度较高。而ZEB家族因其表达的时段性，在临床上的应用仍有待发掘。
参考文献：
[1]Von Burstin J，Eser S，Paul MC，et al.E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex[J].Gastroenterology，2009，137（1）：361-371.
[2]Haslehurst AM， Koti M， Dharsee M， et al.EMT transcription factors snail and slug directly contribute to cisplatin resistance in ovarian cancer[J]. BMC Cancer，2012，12：91.
[3]Vergare D，Merlot B，Lucot JP，et al. Epithelial-mesenchymal transition in ovarian cancer[J].Cancer Lett，2010，291（1）：59-66.
[4]Park SM，Gaur AB，Lengyel E，et al.The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2.Genes Dev，2008，22（7）：894-907.
[5]Bracken CP，Gregory PA，Kolesnikoff N，et al.A double-negative feedback loop between ZEB1-SIP1 and the microRNA-200 family regulates epithelial-mesenchymal transition[J].Cancer Res，2008，68（19）7846-7854.
[6]Liu Z，Sun B，Qi L，et a1.Zinc finger E-box binding homeobox 1 promotes vasculogenic mimicry in colorectal cancer through induction of epithelial-to-mesenchymal transition.Cancer Sci，2012，103（4）：813—820.
[7]DodgeJE，CovensAL，LacchettiC，et a1.Preoperative identificationOf a suspjcious adnexal mass：Asystematic review and meta-analysis.Gyneco1 0ncol，2012，126：157-166.
[8]Korpal M，Lee ES，Hu G，et a1.The miR-200 family inhibits epithelial-mesenchymal-transition and cancer cell migration by directTargeting of E-cadhefin transcriptional repressors ZEBl and ZEB2[J].J Biol Chem，2008，283（22）：14910—14914.
[9]Wu Q，Guo R，Lin M，et a1.MicroRNA-200a inhibits CDl33/1+ ovarian cancer stem cells migration and invasion by targeting E-cadherinrepressor ZEB2[J].Gynecol Oncol，2011，122（1）：149-154.