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摘要：間充质干细胞注射液可以刺激组织生长和修复，自我更新能力强大，能够调节免疫细胞活性，在体外容易扩增和保存。近年来随着干细胞研究的快速发展，通过常规检测来确保脐带间充质干细胞注射液的安全性和有效性，进而为临床提供合格的干细胞产品。
关键词：间充质干细胞；细胞表型；支原体
1.脐带间充质干细胞注射液的制备
1.1试剂及耗材：生理盐水、人血白蛋白、GIBCO 1×Tryple、纱布、酒精棉球。
1.2操作步骤：取出所需试剂，自然平衡至室温。观察各培养瓶中细胞生长状态和融合度，融合度在60-80%则可以进行细胞治疗产品的制备。吸弃所有培养瓶中的培养液。每个T175培养瓶中每次加入20ml生理盐水，清洗瓶底2次。每个T175培养瓶加人5ml Tryple，轻轻摇匀，静置消化2分钟，镜下观察细胞呈球状并已基本悬浮即可终止消化。每个T175培养瓶加入10ml生理盐水适度吹打至细胞完全悬浮后将各培养瓶中的细胞悬液加入到1个250ml离心管中，再以10ml生理盐水依次冲洗培养瓶后加入到同一个250ml离心管中。向细胞悬液中加入含0.1%人血白蛋白的生理盐水溶液，补足体积至200ml，离心300r/8min，吸弃全部上清液。后再重复两次洗涤。细胞洗涤后加入含1%人血白蛋白的生理盐水溶液10ml充分悬浮细胞，取0.2ml细胞悬液进行细胞计数和台盼蓝染色计数细胞活率，根据细胞计数结果加入1%人血白蛋白的生理盐水溶液调整至所需细胞浓度。
2.间充质干细胞的常规检测
2.1无菌、支原体检测：无菌按《中华人民共和国药典》2015年版三部附录 XIIA无菌检查法进行；支原体按《中华人民共和国药典》2015年三部附录 XIIB 支原体检查法进行。
2.2注射液支原体，真菌的镜检检测：取间充质干细胞注射液1ml，平均分装到两个离心管中，一个加入5ml 4%多聚甲醛溶液，涡旋后静置5min后，再加入300?l0.2%TritonX-100，涡旋后静置5min，加入PBS 5ml离心1200r/5min，后弃上清，用500?lPBS吹悬细胞，加入1?l Hoechst33258，涡旋后避光静置5min，离心1200r/5min，弃上清，加入300?lPBS吹悬细胞，取200?l置于24空板.另一个加入1?l吖啶橙染液，涡旋后静置5min，加入PBS 5ml离心1200r/5min，弃上清，加入500?lPBS吹悬细胞，取200?l置于24孔板。分别镜下观察细胞。
2.3内毒素检测：按《中华人民共和国药典》2015年版三部附录XIIE细菌内毒素检查法进行。
2.4细胞形态及活性：观察细胞形态；通过台盼蓝染色确定细胞数及活率[1]。做两次取平均值。
2.5细胞表型纯度：取细胞悬液，使用荧光抗体对细胞进行表面标记，而后采用流式细胞仪测定细胞表型。判定标准为 CD73、CD90 和 CD105 阳性率不低于 95%；CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79α/CD19 和 HLA-DR阳性率不高于 2%[2]
讨论：由于脐带间充质干细胞注射液是一种非最终灭菌的无菌产品，在制备过程中要谨慎处理。建立安全高效的常规检测是脐带间充质干细胞注射液作为一种干细胞治疗技术的必然归宿，建立统一的质检标准[3]是完成干细胞研究从基础向临床顺利转化的保障。
参考文献：
[1] Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.
[2] China Food and Drug Administration. General principles for biological products quality control method validation .（2005-12）[2013-01-02].
[3] Sun L，Wang D，Liang J，et al. Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in severe and refractory systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum，2010，62（8）：2467-2475
[4] Vellasamy S，Sandrasaigaran P，Vidyadaran S，et al. Mesenchymal stem cells of human placenta and umbilical cord suppress T-cell proliferation at G0 phase of cell cycle.
[5] Aggarwal S，Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood，2005，105（4）：1815-1822.
关键词：间充质干细胞；细胞表型；支原体
1.脐带间充质干细胞注射液的制备
1.1试剂及耗材：生理盐水、人血白蛋白、GIBCO 1×Tryple、纱布、酒精棉球。
1.2操作步骤：取出所需试剂，自然平衡至室温。观察各培养瓶中细胞生长状态和融合度，融合度在60-80%则可以进行细胞治疗产品的制备。吸弃所有培养瓶中的培养液。每个T175培养瓶中每次加入20ml生理盐水，清洗瓶底2次。每个T175培养瓶加人5ml Tryple，轻轻摇匀，静置消化2分钟，镜下观察细胞呈球状并已基本悬浮即可终止消化。每个T175培养瓶加入10ml生理盐水适度吹打至细胞完全悬浮后将各培养瓶中的细胞悬液加入到1个250ml离心管中，再以10ml生理盐水依次冲洗培养瓶后加入到同一个250ml离心管中。向细胞悬液中加入含0.1%人血白蛋白的生理盐水溶液，补足体积至200ml，离心300r/8min，吸弃全部上清液。后再重复两次洗涤。细胞洗涤后加入含1%人血白蛋白的生理盐水溶液10ml充分悬浮细胞，取0.2ml细胞悬液进行细胞计数和台盼蓝染色计数细胞活率，根据细胞计数结果加入1%人血白蛋白的生理盐水溶液调整至所需细胞浓度。
2.间充质干细胞的常规检测
2.1无菌、支原体检测：无菌按《中华人民共和国药典》2015年版三部附录 XIIA无菌检查法进行；支原体按《中华人民共和国药典》2015年三部附录 XIIB 支原体检查法进行。
2.2注射液支原体，真菌的镜检检测：取间充质干细胞注射液1ml，平均分装到两个离心管中，一个加入5ml 4%多聚甲醛溶液，涡旋后静置5min后，再加入300?l0.2%TritonX-100，涡旋后静置5min，加入PBS 5ml离心1200r/5min，后弃上清，用500?lPBS吹悬细胞，加入1?l Hoechst33258，涡旋后避光静置5min，离心1200r/5min，弃上清，加入300?lPBS吹悬细胞，取200?l置于24空板.另一个加入1?l吖啶橙染液，涡旋后静置5min，加入PBS 5ml离心1200r/5min，弃上清，加入500?lPBS吹悬细胞，取200?l置于24孔板。分别镜下观察细胞。
2.3内毒素检测：按《中华人民共和国药典》2015年版三部附录XIIE细菌内毒素检查法进行。
2.4细胞形态及活性：观察细胞形态；通过台盼蓝染色确定细胞数及活率[1]。做两次取平均值。
2.5细胞表型纯度：取细胞悬液，使用荧光抗体对细胞进行表面标记，而后采用流式细胞仪测定细胞表型。判定标准为 CD73、CD90 和 CD105 阳性率不低于 95%；CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79α/CD19 和 HLA-DR阳性率不高于 2%[2]
讨论：由于脐带间充质干细胞注射液是一种非最终灭菌的无菌产品，在制备过程中要谨慎处理。建立安全高效的常规检测是脐带间充质干细胞注射液作为一种干细胞治疗技术的必然归宿，建立统一的质检标准[3]是完成干细胞研究从基础向临床顺利转化的保障。
参考文献：
[1] Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.
[2] China Food and Drug Administration. General principles for biological products quality control method validation .（2005-12）[2013-01-02].
[3] Sun L，Wang D，Liang J，et al. Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in severe and refractory systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum，2010，62（8）：2467-2475
[4] Vellasamy S，Sandrasaigaran P，Vidyadaran S，et al. Mesenchymal stem cells of human placenta and umbilical cord suppress T-cell proliferation at G0 phase of cell cycle.
[5] Aggarwal S，Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood，2005，105（4）：1815-1822.