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【摘要】 目的：了解bFGF联合骨髓干细胞动员剂促进大鼠缺血后肢血管新生的作用。方法：将48只大鼠的左侧股动脉与其分支切断，构建大鼠后肢缺血模型，并按随机数字表法分成四组，每组12只，其中A组将重组人bFGF蛋白注入大鼠缺血后肢肌内；B组将重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）注入大鼠皮下；C组大鼠予以bFGF联合rhG-CSF；D组予以均等的生理盐水。治疗持续4周后予以每组大鼠腹主动脉造影，进而观察大鼠侧支血管的具体形成状况，予以内收肌以及腓肠肌肌组织病理切片检查，借助图像分析系统，统计各组大鼠血管密度。行免疫组化检测，分析大鼠血管内皮生长因子阳性表述血管数。结果：在大鼠侧支循环血管条数、血管内皮生长因子阳性表述血管数以及血管密度上，C组>A组>B组>D组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：对于促大鼠缺血后肢血管新生而言，bFGF蛋白与骨髓干细胞动员剂疗效显著，均可改善大鼠肢体的缺血状态，但骨髓干细胞动员剂联合bFGF蛋白改善大鼠缺血肢体更为明显。
【关键词】 bFGF蛋白； rhG-CSF； 骨髓干细胞动员剂； 大鼠； 血管新生
【Abstract】 Objective：To investigate the bFGF combined with bone marrow stem cells mobilization promote vascular ischemic hind limb of the newborn rats.Method：48 rats of the left femoral artery and its branches were cut off， establishment of rat model of hindlimb ischemia and were randomly divided into four groups， 12 rats in each group， the group A of recombinant human bFGF protein was injected into rat ischemia hind limb muscle； in the group B， recombinant human granulocyte colony stimulating factor （rhG-CSF） was injected into rat subcutaneous； the group C rats was given bFGF combined with rhG-CSF； the group D was given normal saline to be equal. The treatment lasted for 4 weeks and then every rat abdominal aortography， specific situation and then the collateral vessels in rats were observed， treated with internal adductor muscle and gastrocnemius muscle tissue pathological examination， with the help of image analysis system， vascular density statistics rats. The rat vascular endothelial growth factor positive expression the number of blood vessels were analyzed by immunohistochemical detection.Result：In the collateral vessels of rats， the number of positive expression of vascular endothelial growth factor vascular number and vascular density， the group C>A>B>D， there were statistically significant differences （P<0.05）.Conclusion：The vascular hind limb ischemia in neonatal rats， bFGF protein and bone marrow stem cell mobilization effect significantly， can improve rat limb ischemia， but bone marrow stem cell mobilization agent with bFGF protein in ischemic rat limb is more obvious.
【Key words】 BFGF； RhG-CSF； Bone marrow stem cells mobilization； Rat； Angiogenesis
First-author’s address：The First Hospital Affiliated to Jiamusi University，Jiamusi 154003，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.007
本文主要通过将重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）注入大鼠缺血后肢肌内，并将重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）注入大鼠皮下，动员大鼠骨髓干细胞，进而观察bFGF联合骨髓干细胞动员剂对于促进大鼠缺血后肢血管新生情况的影响，现报告如下。
1 材料与方法 1.1 实验动物及材料 选择48只大鼠作为研究对象，体重2.4～3.0 kg，平均（2.7±0.2）kg，不局限于雌雄，均为某省动物实验中心供予。制剂重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）与重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）均购自百恩维生物科技有限公司，复方泛影葡胺（购自西安力邦制药有限公司，国药准字H20034058）；兔抗兔血管内皮生长因子多克隆抗体与检测试剂盒购自上海工硕生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 造模及分组 按照大鼠体重，每千克予以大鼠肌内注射50 mg氯胺酮，进行麻醉后，准备消毒与铺巾，在大鼠左侧腹股沟韧带中点处作约1.5 cm左右的一条纵形切口，使其股动脉暴露后予以分离，用1号丝线将股动脉起始处结扎，同时将其切断，完成大鼠后肢缺血模型后，按随机数字表法将其分为A、B、C、D四组，每组12只。
1.2.2 治疗方法 A组在股动脉结扎处予以2000 U bFGF，第3、5、7天分别给药1次；B组按照大鼠体重，每千克于皮下注射10 L rhG-CSF，持续5 d，每天分别给药1次；C组大鼠予以bFGF联合rhG-CSF，给药方法同A、B组；D组予以等量生理盐水。观察大鼠生命体征、切口愈合情况、饮食及左后肢运动等情况。B、C组术后2～8 d进行一次血常规检测，A、D组于术后2、4、6、8 d各进行一次。治疗持续4周后予以每组大鼠腹主动脉造影，进而观察大鼠侧支血管的具体形成状况，予以内收肌以及腓肠肌肌组织病理切片检查，借助图像分析系统，统计各组大鼠血管密度。行免疫组化检测，分析大鼠血管内皮生长因子阳性表述血管数。
1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 总体观察分析 术后，A组1只肠梗阻死亡，B组1只突然死亡，C组1只大鼠麻醉意外死亡，D组1只腹泻死亡，四组大鼠均未出现后肢缺血性坏死现象。术后四组大鼠手术切口均愈合较好，大鼠左后肢均出现毛发脱落。但D组3只跛行，1只下肢足背部溃疡，其余三组愈合较好。
2.2 血常规分析 术后6 d，B组与C组大鼠白细胞在35.4×109/L左右，于术后8 d两组大鼠均恢复正常。A组与D组大鼠血常规未见变化，处在7.8×109/L左右。
2.3 各组侧支血管数比较 经X线片分析得出，四组大鼠的左侧股动脉均发生连续性中断现象，侧支循环血管数量不同。经腹主动脉造影后，在X线片上的经股骨中点出绘制一条直线，使其与股骨纵轴相垂直，发现C组侧支血管数多于A、B组；A组多于B组；A、B、C三组侧支血管数均多于D组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.4 各组血管密度与血管内皮生长因子阳性表述血管数比较 C组血管密度高于A、B组，A组高于B组，A、B、C三组血管密度均高于D组（P<0.05）；在血管内皮生长因子阳性表述血管数上，四组依次为：C组>A组>B组>D组（P<0.05），见表1。
3 讨论
肢体缺血性疾病作为临床上常见的一种致残性疾病，其临床表现主要为3个方面：静息痛、皮肤溃疡及坏疽。在现阶段，肢体缺血性疾病发生率、死亡率高与截肢率均较高，严重威胁着患者的生命[1]。随着血管成形术与外科搭桥术的不断发展，一种新型的血管新生疗法孕育而生。通过运用bFGF、VEGF（血管内皮生长因子）等来促进缺血组织的血管新生，使其形成侧支血管，达到改善缺血组织目的[2]。FGF依据等电点的不同一般分为bFGF与aFGF。bFGF生物学活性较大，作为一种微量蛋白，对血管内膜细胞表达组织具有诱导作用，使其重建蛋白水解酶与血浆酶原激活剂等，促使在血管内皮细胞长入胶原基质中管腔的形成，实现新生血管的生长[3-4]。而rhG-CSF作为一种骨髓干细胞动员剂，可促使外周血干细胞的提高[5-6]。本文研究显示，运用bFGF蛋白可增加侧支血管，A组>D组（P<0.05），改善缺血状态。同时，加大了VEGF蛋白表达，C组>A组>B组>D组（P<0.05），加快了毛细血管的新生速度。由此表明，将bFGF注射在缺血组织内，适时增加局部外源性bFGF蛋白量，大鼠皮下注入rhG-CSF，积极诱导了干细胞的分化，有助于血管新生，这与相关研究结论具有一致性。
综上所述，bFGF蛋白与骨髓干细胞动员剂促大鼠缺血后肢血管新生疗效显著，有助于改善大鼠肢体缺血状态。
参考文献
[1]彭峰林，郭艳菊，张林.间歇运动训练和急性间歇运动对缺血/再灌注大鼠心电图及血清心肌酶的影响[J].中国体育科技，2010，51（3）：102-105.
[2]杨洋，吴迪，王颜，等.重组人粒细胞集落刺激因子动员急性心肌缺血大鼠自体骨髓干细胞归巢缺血心肌的短期安全性评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，12（10）：1829-1834.
[3]李磊.机械振动协同骨髓干细胞动员对大鼠闭合性骨折愈合血管生成的影响及其可能机制[D].西安：陕西师范大学，2012.
[4]李慧，孙新华，刘超.实验性牙移动初期大鼠牙周组织CD133+血管内皮祖细胞的表达[J].华西口腔医学杂志，2010，27（5）：468-470.
[5]王晓杰，李晶，田海山，等.重组人碱性成纤维细胞生长因子促进急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管再生[J].吉林大学学报（医学版），2009，50（6）：979-982.
[6]杨敏，陈广玲，陈畅，等.人参皂苷Rg1对心肌梗死大鼠心脏的促血管生成作用研究[J].中国中医急症，2009，17（3）：403-405.
（收稿日期：2014-04-10） （本文编辑：蔡元元）
【关键词】 bFGF蛋白； rhG-CSF； 骨髓干细胞动员剂； 大鼠； 血管新生
【Abstract】 Objective：To investigate the bFGF combined with bone marrow stem cells mobilization promote vascular ischemic hind limb of the newborn rats.Method：48 rats of the left femoral artery and its branches were cut off， establishment of rat model of hindlimb ischemia and were randomly divided into four groups， 12 rats in each group， the group A of recombinant human bFGF protein was injected into rat ischemia hind limb muscle； in the group B， recombinant human granulocyte colony stimulating factor （rhG-CSF） was injected into rat subcutaneous； the group C rats was given bFGF combined with rhG-CSF； the group D was given normal saline to be equal. The treatment lasted for 4 weeks and then every rat abdominal aortography， specific situation and then the collateral vessels in rats were observed， treated with internal adductor muscle and gastrocnemius muscle tissue pathological examination， with the help of image analysis system， vascular density statistics rats. The rat vascular endothelial growth factor positive expression the number of blood vessels were analyzed by immunohistochemical detection.Result：In the collateral vessels of rats， the number of positive expression of vascular endothelial growth factor vascular number and vascular density， the group C>A>B>D， there were statistically significant differences （P<0.05）.Conclusion：The vascular hind limb ischemia in neonatal rats， bFGF protein and bone marrow stem cell mobilization effect significantly， can improve rat limb ischemia， but bone marrow stem cell mobilization agent with bFGF protein in ischemic rat limb is more obvious.
【Key words】 BFGF； RhG-CSF； Bone marrow stem cells mobilization； Rat； Angiogenesis
First-author’s address：The First Hospital Affiliated to Jiamusi University，Jiamusi 154003，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.007
本文主要通过将重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）注入大鼠缺血后肢肌内，并将重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）注入大鼠皮下，动员大鼠骨髓干细胞，进而观察bFGF联合骨髓干细胞动员剂对于促进大鼠缺血后肢血管新生情况的影响，现报告如下。
1 材料与方法 1.1 实验动物及材料 选择48只大鼠作为研究对象，体重2.4～3.0 kg，平均（2.7±0.2）kg，不局限于雌雄，均为某省动物实验中心供予。制剂重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）与重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）均购自百恩维生物科技有限公司，复方泛影葡胺（购自西安力邦制药有限公司，国药准字H20034058）；兔抗兔血管内皮生长因子多克隆抗体与检测试剂盒购自上海工硕生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 造模及分组 按照大鼠体重，每千克予以大鼠肌内注射50 mg氯胺酮，进行麻醉后，准备消毒与铺巾，在大鼠左侧腹股沟韧带中点处作约1.5 cm左右的一条纵形切口，使其股动脉暴露后予以分离，用1号丝线将股动脉起始处结扎，同时将其切断，完成大鼠后肢缺血模型后，按随机数字表法将其分为A、B、C、D四组，每组12只。
1.2.2 治疗方法 A组在股动脉结扎处予以2000 U bFGF，第3、5、7天分别给药1次；B组按照大鼠体重，每千克于皮下注射10 L rhG-CSF，持续5 d，每天分别给药1次；C组大鼠予以bFGF联合rhG-CSF，给药方法同A、B组；D组予以等量生理盐水。观察大鼠生命体征、切口愈合情况、饮食及左后肢运动等情况。B、C组术后2～8 d进行一次血常规检测，A、D组于术后2、4、6、8 d各进行一次。治疗持续4周后予以每组大鼠腹主动脉造影，进而观察大鼠侧支血管的具体形成状况，予以内收肌以及腓肠肌肌组织病理切片检查，借助图像分析系统，统计各组大鼠血管密度。行免疫组化检测，分析大鼠血管内皮生长因子阳性表述血管数。
1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 总体观察分析 术后，A组1只肠梗阻死亡，B组1只突然死亡，C组1只大鼠麻醉意外死亡，D组1只腹泻死亡，四组大鼠均未出现后肢缺血性坏死现象。术后四组大鼠手术切口均愈合较好，大鼠左后肢均出现毛发脱落。但D组3只跛行，1只下肢足背部溃疡，其余三组愈合较好。
2.2 血常规分析 术后6 d，B组与C组大鼠白细胞在35.4×109/L左右，于术后8 d两组大鼠均恢复正常。A组与D组大鼠血常规未见变化，处在7.8×109/L左右。
2.3 各组侧支血管数比较 经X线片分析得出，四组大鼠的左侧股动脉均发生连续性中断现象，侧支循环血管数量不同。经腹主动脉造影后，在X线片上的经股骨中点出绘制一条直线，使其与股骨纵轴相垂直，发现C组侧支血管数多于A、B组；A组多于B组；A、B、C三组侧支血管数均多于D组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.4 各组血管密度与血管内皮生长因子阳性表述血管数比较 C组血管密度高于A、B组，A组高于B组，A、B、C三组血管密度均高于D组（P<0.05）；在血管内皮生长因子阳性表述血管数上，四组依次为：C组>A组>B组>D组（P<0.05），见表1。
3 讨论
肢体缺血性疾病作为临床上常见的一种致残性疾病，其临床表现主要为3个方面：静息痛、皮肤溃疡及坏疽。在现阶段，肢体缺血性疾病发生率、死亡率高与截肢率均较高，严重威胁着患者的生命[1]。随着血管成形术与外科搭桥术的不断发展，一种新型的血管新生疗法孕育而生。通过运用bFGF、VEGF（血管内皮生长因子）等来促进缺血组织的血管新生，使其形成侧支血管，达到改善缺血组织目的[2]。FGF依据等电点的不同一般分为bFGF与aFGF。bFGF生物学活性较大，作为一种微量蛋白，对血管内膜细胞表达组织具有诱导作用，使其重建蛋白水解酶与血浆酶原激活剂等，促使在血管内皮细胞长入胶原基质中管腔的形成，实现新生血管的生长[3-4]。而rhG-CSF作为一种骨髓干细胞动员剂，可促使外周血干细胞的提高[5-6]。本文研究显示，运用bFGF蛋白可增加侧支血管，A组>D组（P<0.05），改善缺血状态。同时，加大了VEGF蛋白表达，C组>A组>B组>D组（P<0.05），加快了毛细血管的新生速度。由此表明，将bFGF注射在缺血组织内，适时增加局部外源性bFGF蛋白量，大鼠皮下注入rhG-CSF，积极诱导了干细胞的分化，有助于血管新生，这与相关研究结论具有一致性。
综上所述，bFGF蛋白与骨髓干细胞动员剂促大鼠缺血后肢血管新生疗效显著，有助于改善大鼠肢体缺血状态。
参考文献
[1]彭峰林，郭艳菊，张林.间歇运动训练和急性间歇运动对缺血/再灌注大鼠心电图及血清心肌酶的影响[J].中国体育科技，2010，51（3）：102-105.
[2]杨洋，吴迪，王颜，等.重组人粒细胞集落刺激因子动员急性心肌缺血大鼠自体骨髓干细胞归巢缺血心肌的短期安全性评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，12（10）：1829-1834.
[3]李磊.机械振动协同骨髓干细胞动员对大鼠闭合性骨折愈合血管生成的影响及其可能机制[D].西安：陕西师范大学，2012.
[4]李慧，孙新华，刘超.实验性牙移动初期大鼠牙周组织CD133+血管内皮祖细胞的表达[J].华西口腔医学杂志，2010，27（5）：468-470.
[5]王晓杰，李晶，田海山，等.重组人碱性成纤维细胞生长因子促进急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管再生[J].吉林大学学报（医学版），2009，50（6）：979-982.
[6]杨敏，陈广玲，陈畅，等.人参皂苷Rg1对心肌梗死大鼠心脏的促血管生成作用研究[J].中国中医急症，2009，17（3）：403-405.
（收稿日期：2014-04-10） （本文编辑：蔡元元）