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摘要：目的 建立罗汉膏中罗汉果皂苷V的高效液相色谱测定方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent SB-C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-水（22：78），检测波长为203 nm，柱温为30℃，流速为1.0 mL/min。结果 罗汉膏中的罗汉果皂苷V线性关系良好（范围：0.1954～3.908μg，r=0.9999），加样回收率平均为100.08%，RSD为2.16%。结论 所建方法简便、快速，可用于罗汉膏中罗汉果皂苷V的含量测定。
关键词：罗汉膏；罗汉果皂苷V；高效液相色谱法
中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）10-0057-03
【Abstract】Objective：To establish a high performance liquid chromatographic method for the determination of mogroside V in Luohan Ointment. Methods：High performance liquid chromatography was used. The column was Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），the mobile phase was acetonitrile-water（22：78），the detection wavelength was 203 nm，the column temperature was 30°C，and the flow rate was 1.0 mL/min. Results：The Mogroside V in Luohan Ointment has a good linearity at the range of 0.1954 to3.908μg，r=0.9999. The average recovery rate was 100.08% and the RSD was 2.16%. Conclusion：The method is simple and rapid，and can be used to determine the content of mogroside V in Luohan Ointment.
【Key words】Luohan Ointment，mogroside V，high performance liquid chromatography
罗汉膏为泸州市中医医院开发研究的医院中药制剂，主要由罗汉果、百合、鱼腥草等药味组成，具有清热润肺，化痰止咳功效，常用于治疗肺热型咳嗽，且药物均为药食两用，有很好的药用效果和保健作用。其君药罗汉果具有镇咳、祛痰、平喘、增强免疫等多种活性，并且近年来罗汉果也被开发成多种产品上市[1-3]。为了保证罗汉膏的质量稳定可靠，对君药罗汉果的主成分罗汉果皂苷V的含量进行测定[4，5]，并进行方法学验证，为罗汉膏的质量控制提供理论依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 安捷伦1260高效液相色谱仪（美国安捷伦有限公司），FA2004型万分之一电子天平（上海安亭电子仪器厂），SOP型十万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），CQ-250A-DST型超声波清洗器（上海跃进医用光学器械厂），HH型数显恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂）。
1.2 试药 罗汉果皂苷V（批号：111754-201502，供含量測定用），为中国食品药品研究院提供。罗汉膏为本院制剂室提供；乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇、乙醇等试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Agilent SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相为乙腈-水（22：78）；检测波长为203 nm；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min；进样量10 μL；理论塔板数按主成分罗汉果皂苷V计算应不低于3000。
2.2 对照品溶液的制备[6] 精密称取罗汉果皂苷V对照品适量，加流动相乙腈-水（22：78）溶解并制成1 mL含0.2 mg的溶液，作为罗汉果皂苷V对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 精密称取罗汉膏成品5 g，置于具塞锥形瓶中，加乙醇25 mL，塞好盖子，称定重量，加热回流1 h，冷却后，称定重量，加乙醇补足加热回流减失的重量，摇匀，用滤纸过滤。精密吸取5 mL续滤液，水浴挥干，残渣加流动相溶解并定容至10 mL，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为罗汉膏的供试品溶液。
2.4 阴性溶液的制备 精密称取缺罗汉果的阴性制剂5 g，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，作为缺罗汉果的阴性对照溶液。
2.5 系统适应性试验 精密吸取罗汉果皂苷V对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μl，按“2.1”项下的色谱条件进样，进行HPLC测定[7]。结果表明，分离度良好，缺罗汉果的阴性对照溶液在主成分峰位处无干扰（见图1）。
2.6 线性关系的考察 分别精密吸取罗汉果皂苷V对照品溶液1、2、4、8、10、16、20μl，按“2.1”项下的色谱条件进行HPLC测定，以进样质量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程：Y=212.7X-2.684（r=0.9999），说明罗汉果皂苷V在0.1954～3.908μg范围内线性良好。
2.7 精密度试验 精密吸取罗汉果皂苷V对照品溶液10 μL，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，记录峰面积，RSD为1.00%，结果表明，仪器精密度良好。
2.8 重复性试验 精密称取同一批号的罗汉膏6份，每份5 g，按照“2.3”项下的制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分别精密吸取10 μL进样测定，计算罗汉果皂苷V的含量，含量的RSD为1.56%，结果表明，测定方法的重复性良好。 2.9 稳定性考察 精密吸取同一批号的供试品溶液，在不同时间0、2、4、6、8h，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，RSD为1.57%，结果表明，罗汉膏供试品溶液放置8h内基本稳定。
2.10 加样回收率试验 精密称取已知罗汉果皂苷V 含量的罗汉膏6份，分别加入适量的罗汉果皂苷V对照品溶液，按“2.3”项下方法制备，分别精密吸取10μl按“2.1”项下的色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。
由表1可知，罗汉果皂苷V的平均加样回收率为100.08%，六份加样回收率均在95%-105%之间，且RSD<3%，说明方法的准确度良好。
2.11 耐用性试验 精密吸取供试品溶液10 μL，分别改变温度±5℃，改变流动相比例±5%，改变色谱柱为Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），按“2.1”项下的色谱条件进样测定，计算罗汉果皂苷V的含量，结果三种条件下测定的含量RSD均小于1，表明该方法耐用性良好。
2.12 样品含量测定 分别精密称取中试生产的三批样品（批号为20161101，20161102，20161103）5 g按照“2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件精密吸取10μl进样测定，记录峰面积，计算罗汉果皂苷V的含量，结果见表2。
3 讨论
在罗汉果皂苷V含量测定中，供试品溶液制备方法分别考察了过AB-8树脂柱洗脱、乙醇回流、甲醇回流、乙醇超声、甲醇超声等方法，结果表明，乙醇超声制备出的样品存在含量不均的现象，其余几种方法提取结果差异不大。从节省制样时间及试剂毒性大小多方面考虑，最后选择制备样品的方法为乙醇回流提取。
本试验比较了甲醇-水、乙腈-水等比例条件下对样品中罗汉果皂苷V分离度的影响，结果发现，采用乙腈-水（22：78）洗脱时罗汉果皂苷V能得到良好的分离。
在含量测定方法学研究过程中，发现室温对样品分离度影响较大，故在测定样品时注意控制室内温度。
罗汉膏是泸州市中医医院根据治疗咳嗽的经验，摸索出治疗肺热型咳嗽的经验方制成的煎膏剂，便于携带和服用，为肺热型咳嗽疾病提供一種新的制剂。本研究采用外标法测定君药罗汉果的主成分罗汉果皂苷V，对罗汉膏的质量控制进行含量测定研究，根据研究结果对三批中试生产的罗汉膏成品进行含量测定，结果稳定可靠，为该制剂的质量评价提供了科学的理论依据。
参考文献：
[1]刘婷，王旭华，李春，等.罗汉果皂苷V的镇咳、祛痰及解痉作用研究[J].中国药学杂志，2007，42（20）：1534-1536.
[2]吴旖，江仁望，赵斌.百部新碱与罗汉果皂苷Ⅴ联用对小鼠的镇咳、祛痰作用研究[J].中国药房，2017，28（13）：1755-1757.
[3]张庆莲，黄娟，吴智惠，等.罗汉果的药理及开发应用的研究概况[J].药学研究，2017，32（2）：164-165.
[4]邓梦霞，张桂芬，刘欢.罗汉果止咳糖浆中罗汉果皂苷V的含量测定[J].中成药，2010，32（2）：340-341.
[5]刘元，莫海涛，文志云，等.复方罗汉果止咳片质量标准研究[J].中成药，2010，32（2）：341-343.
[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015：212.
[7]屠寒，卢金清，江汉美，等.HPLC法测定罗麦颗粒中罗汉果皂苷V、甘草苷和甘草酸的含量[J].中医药导报，2017，23（4）：56-62.
关键词：罗汉膏；罗汉果皂苷V；高效液相色谱法
中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）10-0057-03
【Abstract】Objective：To establish a high performance liquid chromatographic method for the determination of mogroside V in Luohan Ointment. Methods：High performance liquid chromatography was used. The column was Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），the mobile phase was acetonitrile-water（22：78），the detection wavelength was 203 nm，the column temperature was 30°C，and the flow rate was 1.0 mL/min. Results：The Mogroside V in Luohan Ointment has a good linearity at the range of 0.1954 to3.908μg，r=0.9999. The average recovery rate was 100.08% and the RSD was 2.16%. Conclusion：The method is simple and rapid，and can be used to determine the content of mogroside V in Luohan Ointment.
【Key words】Luohan Ointment，mogroside V，high performance liquid chromatography
罗汉膏为泸州市中医医院开发研究的医院中药制剂，主要由罗汉果、百合、鱼腥草等药味组成，具有清热润肺，化痰止咳功效，常用于治疗肺热型咳嗽，且药物均为药食两用，有很好的药用效果和保健作用。其君药罗汉果具有镇咳、祛痰、平喘、增强免疫等多种活性，并且近年来罗汉果也被开发成多种产品上市[1-3]。为了保证罗汉膏的质量稳定可靠，对君药罗汉果的主成分罗汉果皂苷V的含量进行测定[4，5]，并进行方法学验证，为罗汉膏的质量控制提供理论依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 安捷伦1260高效液相色谱仪（美国安捷伦有限公司），FA2004型万分之一电子天平（上海安亭电子仪器厂），SOP型十万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），CQ-250A-DST型超声波清洗器（上海跃进医用光学器械厂），HH型数显恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂）。
1.2 试药 罗汉果皂苷V（批号：111754-201502，供含量測定用），为中国食品药品研究院提供。罗汉膏为本院制剂室提供；乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇、乙醇等试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Agilent SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相为乙腈-水（22：78）；检测波长为203 nm；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min；进样量10 μL；理论塔板数按主成分罗汉果皂苷V计算应不低于3000。
2.2 对照品溶液的制备[6] 精密称取罗汉果皂苷V对照品适量，加流动相乙腈-水（22：78）溶解并制成1 mL含0.2 mg的溶液，作为罗汉果皂苷V对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 精密称取罗汉膏成品5 g，置于具塞锥形瓶中，加乙醇25 mL，塞好盖子，称定重量，加热回流1 h，冷却后，称定重量，加乙醇补足加热回流减失的重量，摇匀，用滤纸过滤。精密吸取5 mL续滤液，水浴挥干，残渣加流动相溶解并定容至10 mL，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为罗汉膏的供试品溶液。
2.4 阴性溶液的制备 精密称取缺罗汉果的阴性制剂5 g，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，作为缺罗汉果的阴性对照溶液。
2.5 系统适应性试验 精密吸取罗汉果皂苷V对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μl，按“2.1”项下的色谱条件进样，进行HPLC测定[7]。结果表明，分离度良好，缺罗汉果的阴性对照溶液在主成分峰位处无干扰（见图1）。
2.6 线性关系的考察 分别精密吸取罗汉果皂苷V对照品溶液1、2、4、8、10、16、20μl，按“2.1”项下的色谱条件进行HPLC测定，以进样质量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程：Y=212.7X-2.684（r=0.9999），说明罗汉果皂苷V在0.1954～3.908μg范围内线性良好。
2.7 精密度试验 精密吸取罗汉果皂苷V对照品溶液10 μL，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，记录峰面积，RSD为1.00%，结果表明，仪器精密度良好。
2.8 重复性试验 精密称取同一批号的罗汉膏6份，每份5 g，按照“2.3”项下的制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分别精密吸取10 μL进样测定，计算罗汉果皂苷V的含量，含量的RSD为1.56%，结果表明，测定方法的重复性良好。 2.9 稳定性考察 精密吸取同一批号的供试品溶液，在不同时间0、2、4、6、8h，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，RSD为1.57%，结果表明，罗汉膏供试品溶液放置8h内基本稳定。
2.10 加样回收率试验 精密称取已知罗汉果皂苷V 含量的罗汉膏6份，分别加入适量的罗汉果皂苷V对照品溶液，按“2.3”项下方法制备，分别精密吸取10μl按“2.1”项下的色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。
由表1可知，罗汉果皂苷V的平均加样回收率为100.08%，六份加样回收率均在95%-105%之间，且RSD<3%，说明方法的准确度良好。
2.11 耐用性试验 精密吸取供试品溶液10 μL，分别改变温度±5℃，改变流动相比例±5%，改变色谱柱为Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），按“2.1”项下的色谱条件进样测定，计算罗汉果皂苷V的含量，结果三种条件下测定的含量RSD均小于1，表明该方法耐用性良好。
2.12 样品含量测定 分别精密称取中试生产的三批样品（批号为20161101，20161102，20161103）5 g按照“2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件精密吸取10μl进样测定，记录峰面积，计算罗汉果皂苷V的含量，结果见表2。
3 讨论
在罗汉果皂苷V含量测定中，供试品溶液制备方法分别考察了过AB-8树脂柱洗脱、乙醇回流、甲醇回流、乙醇超声、甲醇超声等方法，结果表明，乙醇超声制备出的样品存在含量不均的现象，其余几种方法提取结果差异不大。从节省制样时间及试剂毒性大小多方面考虑，最后选择制备样品的方法为乙醇回流提取。
本试验比较了甲醇-水、乙腈-水等比例条件下对样品中罗汉果皂苷V分离度的影响，结果发现，采用乙腈-水（22：78）洗脱时罗汉果皂苷V能得到良好的分离。
在含量测定方法学研究过程中，发现室温对样品分离度影响较大，故在测定样品时注意控制室内温度。
罗汉膏是泸州市中医医院根据治疗咳嗽的经验，摸索出治疗肺热型咳嗽的经验方制成的煎膏剂，便于携带和服用，为肺热型咳嗽疾病提供一種新的制剂。本研究采用外标法测定君药罗汉果的主成分罗汉果皂苷V，对罗汉膏的质量控制进行含量测定研究，根据研究结果对三批中试生产的罗汉膏成品进行含量测定，结果稳定可靠，为该制剂的质量评价提供了科学的理论依据。
参考文献：
[1]刘婷，王旭华，李春，等.罗汉果皂苷V的镇咳、祛痰及解痉作用研究[J].中国药学杂志，2007，42（20）：1534-1536.
[2]吴旖，江仁望，赵斌.百部新碱与罗汉果皂苷Ⅴ联用对小鼠的镇咳、祛痰作用研究[J].中国药房，2017，28（13）：1755-1757.
[3]张庆莲，黄娟，吴智惠，等.罗汉果的药理及开发应用的研究概况[J].药学研究，2017，32（2）：164-165.
[4]邓梦霞，张桂芬，刘欢.罗汉果止咳糖浆中罗汉果皂苷V的含量测定[J].中成药，2010，32（2）：340-341.
[5]刘元，莫海涛，文志云，等.复方罗汉果止咳片质量标准研究[J].中成药，2010，32（2）：341-343.
[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015：212.
[7]屠寒，卢金清，江汉美，等.HPLC法测定罗麦颗粒中罗汉果皂苷V、甘草苷和甘草酸的含量[J].中医药导报，2017，23（4）：56-62.