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【摘 要】目的：从黄花蒿中分离鉴定青蒿素生物合成途径关键酶——青蒿醛双键还原编码基因（Dbr2）并研究其表达特性，藉此探索提高该基因表达量并进一步促进青蒿素合成的途径。方法：采用PCR法从黄花蒿总RNA中分离Dbr2基因编码序列，并采用实时荧光定量PCR法定量检测Dbr2基因在多种人工模拟环境中的转录表达模式。结果：从黄花蒿中分离出1179bp的Dbr2基因编码序列。经过低温、紫外辐射、淹水、脱水、复水、真菌诱激子、葡萄糖、水杨酸处理，Dbr2 mRNA水平分别提高2.5、3.7、10.8、6.0、34.5、28.7、6.3和8.5倍。结论：黄花蒿Dbr2基因可能具有环境诱导表达特性。
【关键词】黄花蒿；Dbr2；青蒿素；诱导表达
青蒿素及其衍生物已成为最重要的一线抗疟药，黄花蒿（Artemisia annua L.）是目前发现的唯一能合成青蒿素的天然植物，但产量很低，仅为0.01-0.8%左右。近年，青蒿素代谢工程研究取得突破性进展，多个相关的关键酶基因相继被克隆。Covello研究团队在黄花蒿腺毛中发现一种类属于烯醇还原酶家族的蛋白催化青蒿醛C11-C13位的还原反应，并将其命名为青蒿醛11（13）双键还原酶。在酵母中同步表达其编码基因（Dbr2）和其他青蒿素合成基因——法呢基焦磷酸合酶、紫穗槐二烯合酶、细胞色素P450单加氧酶及细胞色素P450氧化还原酶编码基因可获得青蒿素合成前体——双氢青蒿酸[1]。以往的研究表明，青蒿素合成相关基因的表达多具有组织、发育及条件诱导特性，并且与青蒿素的合成呈正相关[2]。为了进一步研究Dbr2基因的表达规律及其与青蒿素合成的相关性，本研究分离了Dbr2基因并定量检测了其在各种人工模拟胁迫条件下的表达水平，以期探讨促进青蒿素生物合成的途径。
1 材料与方法
1.1 黄花蒿（A. annua）种子（重庆酉阳，华阳2号）由广州中医药大学青蒿研究中心鉴定，本实验室保存。SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自TOYOBO公司，酵母提取物购自OXOID公司，水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MJ）购自Sigma-Aldrich公司。引物由Invitrogen公司合成。
1.2 诱导处理 发芽种子在含0.8%琼脂的1/2MS固体培养基上25℃培养30 d后，选取长势均一的无菌苗进行各种诱导条件处理。低温：4℃24h；热休克：40℃ 30min，然后25℃ 2h，最后50℃ 1h；紫外：距离紫外灯（254 nm，20 W）下约20cm直接照射1h；淹水（缺氧）：其根部完全没入无菌蒸馏水中，25℃24h；脱水（干旱）：淹水处理6h后移出，置于无菌滤纸上，继续25℃6h；复水：脱水处理后，加入无菌蒸馏水淹没其根部，继续25℃12h；真菌诱激子：含50mg•L-1酵母提取物的MS液体培养基中25℃培养7d；葡萄糖：含3%葡萄糖的MS液体培养基中25℃培养7d；高盐：含250 mmol•L-1 NaCl 的MS液体培养基中25℃培养7d；SA：含1 mmol•L-1SA的MS液体培养基中25℃培养7d；MJ：含100 μmol•L-1 MJ的MS液体培养基中25℃培养7d；对照：1/2MS固体培养基，25℃培养24 h或7 d。以上培养液均为pH7.0，培养条件光周期均为16 h光/8 h暗。
1.3 Dbr2基因的分离与序列分析 黄花蒿种子发芽培养30 d后取100 mg叶片提取总RNA并进行逆转录反应合成cDNA。根据文献[1]合成引物（Dbr2-1：5’-CACCATGTCTGAAAAACC AACCTTG-3’与Dbr2-2： 5’-GCTCATAAGATGC ACCTTAAT AAG-3’），扩增Dbr2基因编码序列。扩增条件为：98 ℃ 10 sec，45 ℃15 sec，72 ℃ 2 min，30个循环。1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化PCR产物，连接到pMD20-T载体并转化DH5，对经过酶切鉴定获得的阳性克隆由Invitrogen公司进行序列测定。
1.4 实时荧光定量PCR（RTFQ-PCR）检测 取各种诱导处理后的黄花蒿叶片100 mg ，提取总RNA并进行逆转录反应合成cDNA。以10倍稀释的cDNA为模板，actin基因为内参进行RTFQ-PCR反应检测Dbr2的转录水平，方法详见文献[2]。定量PCR引物根据相应的青蒿基因序列设计引物，分别为Dbr2-5：5’-CTCAAGGGGATGCTGATTTG-3’ 与Dbr2-6：5’-GGTAATC CGTGTACCCAACG-3’，扩增长度为150 bp；actin-5：5’-GCATCCCGTTCTTTTGACTG-3’与actin-6：5’-GCTCTGCTG TGGTGGTGAA-3’，扩增长度为317 bp。基因的相对转录水平以Dbr2 mRNA copies/actin mRNA copies表示。
1.5 统计学分析 实验中每个指标的测定均重复9个样本（n=9），每个样本测定均重复3次。数据采用SPSS13.0软件进行统计，采用配对t检验进行显著性分析。
2 结果
2.1 Dbr2基因的分离与序列分析 PCR扩增后的产物经回收后克隆于pMD20-T载体，取5个经过酶切鉴定的阳性克隆进行测序。测序结果显示，扩增片段编码序列长度为1179 bp，编码392个氨基酸。序列已上传GenBank，收录号为EU848577。序列比对分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）显示，该序列与番茄（GenBank收录号：AJ278332）、巴西橡胶树（GenBank收录号：DQ004685）、拟南芥（GenBank收录号：AF132212）等其他物种的二烯醇还原酶基因同源性为73%和68%，与GenBank收录的另一Dbr2 mRNA序列（收录号：EU704257）同源性为94.5%。两者由核苷酸推导的氨基酸序列同源性为94.6%，His239、Phe69与底物结合相关的氨基酸位点，以及His180 、His183、Tyr185与酶催化活性相关的氨基酸位点高度保守。本研究序列羧基末端（Ser-Arg-Leu）可能是过氧化物酶体定位点，且附近有一段N383-L389结构，而EU704257序列羧基末端替代为Ser-Leu-Leu，可能与不同亚细胞器定位有关。
2.2 胁迫条件下Dbr2基因的表达模式 采用RTFQ-PCR方法检测了Dbr2基因在多种人工模拟胁迫条件下的转录水平，得到Dbr2基因和内参actin基因的标准曲线方程及决定系数分别为：actin：Y = -3.609022X + 38.008945，R2 = 0.997841；Dbr2：Y = -3.678958X + 40.386537，R2 = 0.999076。黄花蒿无菌苗经过低温、紫外辐射、淹水、脱水、复水、真菌诱激子（酵母提取物）、葡萄糖、SA处理，Dbr2 mRNA水平分别提高2.5、3.7、10.8、6.0、34.5、28.7、6.3和8.5倍（P<0.01），其中水淹（缺氧）和真菌诱激对Dbr2基因转录刺激作用较大。而热休克、NaCl高盐和MJ处理后，Dbr2 mRNA水平与对照无显著差异（P>0.05）。
3 讨论
青蒿素的特异性生物合成从倍半萜共同前体法呢基焦磷酸（FPP）开始，FPP经黄花蒿所特有的紫穗槐二烯合酶（ADS）环化生成紫穗槐-4,11-二烯。从分子结构分析，紫穗槐二烯转化为双氢青蒿酸需经过C12位的氧化和C11-C13位的还原反应。C12位的氧化已知由细胞色素P450单加氧酶（CYP71AV1）
催化完成，Dbr2的发现使得C11-C13位的还原问题得到解答。本研究从黄花蒿中分离了Dbr2基因，由其核苷酸序列推导的氨基酸序列具有典型的二烯醇还原酶保守结构。不同地域或不同品系间，青蒿素生物合成相关基因（如ads、cyp71av1等）也会出现多态性现象，碱基和氨基酸序列会存在细小差异，至于这种差异是否会引起酶活性改变，从而影响青蒿素生物合成，目前还没有相关研究。
青蒿素作为一种次生代谢产物，外界条件刺激，包括低温、真菌感染及真菌诱激子、多糖、植物激素等都可以促进其合成[4]。有研究指出低温、水杨酸等条件刺激可通过上调青蒿素合成基因表达促进青蒿素前体合成和刺激产生活性氧促进青蒿素前体转化来提高青蒿素合成[5]。多个青蒿素生物合成相关基因（如hmgr、ads、cyp71av1等）已被证明具有发育和胁迫条件诱导表达特性，且与青蒿素生物合成呈正相关。进一步研究更发现，ads和cyp71av1基因启动子含有环境响应诱导元件，低温、紫外辐射、干旱等胁迫条件能刺激其调控基因高效表达[6]。本研究发现，作为青蒿素合成关键酶编码基因，Dbr2也同样具有诱导表达特性，对于低温、紫外辐射、淹水、脱水、复水、真菌诱激子、葡萄糖、SA刺激等多个人工模拟胁迫条件具有响应，mRNA水平普遍提高，其中对淹水（缺氧）、复水（干旱+缺氧）和真菌诱激子刺激响应更为明显。黄花蒿在世界范围分布广泛，但绝大多数地区黄花蒿中的青蒿素含量都很低，无生产利用价值。研究启发我们可以通过选用相应的胁迫条件，促进青蒿素合成基因表达，从而提高青素合成产量。
参考文献
[1] Zhang Y, Teoch KH, Reed DW, et al. The molecular cloning of artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase and its role in glandular trichome-dependent biosynthesis of artemisinin in Artemisia annua [J]. J Biol Chem, 2008, 283(31): 21501-21508
[2] Zeng QP, Zhao C, Yin L, et al. Cloning of artemisinin biosynthetic cDNAs and novel ESTs and quantification of low temperature-induced gene overexpression [J]. Sci China (Ser C), 2008, 51(3): 232-244
[3] 杨瑞仪, 杨雪芹, 冯丽玲. 青蒿素生物合成基因的转录谱分析[J]. 广州中医药大学学报, 2010, 27(4): 393-398
[4] Baldi A, Dixit VK. Yield enhancement strategies for artemisinin production by suspension cultures of Artemisia annua [J]. Bioresour Technol, 2008, 99(11): 4609-4614.
[5] Pu GB, Ma DM, Chen JL, et al. Salicylic acid activates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L [J]. Plant Cell Rep, 2009, 28(7): 1127-1135.
[6] 杨瑞仪, 杨雪芹, 冯丽玲等. 黄花蒿cyp71av1启动子的分离及表达特性分析[J]. 中草药, 2010, 42(4): 765-769.
【关键词】黄花蒿；Dbr2；青蒿素；诱导表达
青蒿素及其衍生物已成为最重要的一线抗疟药，黄花蒿（Artemisia annua L.）是目前发现的唯一能合成青蒿素的天然植物，但产量很低，仅为0.01-0.8%左右。近年，青蒿素代谢工程研究取得突破性进展，多个相关的关键酶基因相继被克隆。Covello研究团队在黄花蒿腺毛中发现一种类属于烯醇还原酶家族的蛋白催化青蒿醛C11-C13位的还原反应，并将其命名为青蒿醛11（13）双键还原酶。在酵母中同步表达其编码基因（Dbr2）和其他青蒿素合成基因——法呢基焦磷酸合酶、紫穗槐二烯合酶、细胞色素P450单加氧酶及细胞色素P450氧化还原酶编码基因可获得青蒿素合成前体——双氢青蒿酸[1]。以往的研究表明，青蒿素合成相关基因的表达多具有组织、发育及条件诱导特性，并且与青蒿素的合成呈正相关[2]。为了进一步研究Dbr2基因的表达规律及其与青蒿素合成的相关性，本研究分离了Dbr2基因并定量检测了其在各种人工模拟胁迫条件下的表达水平，以期探讨促进青蒿素生物合成的途径。
1 材料与方法
1.1 黄花蒿（A. annua）种子（重庆酉阳，华阳2号）由广州中医药大学青蒿研究中心鉴定，本实验室保存。SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自TOYOBO公司，酵母提取物购自OXOID公司，水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MJ）购自Sigma-Aldrich公司。引物由Invitrogen公司合成。
1.2 诱导处理 发芽种子在含0.8%琼脂的1/2MS固体培养基上25℃培养30 d后，选取长势均一的无菌苗进行各种诱导条件处理。低温：4℃24h；热休克：40℃ 30min，然后25℃ 2h，最后50℃ 1h；紫外：距离紫外灯（254 nm，20 W）下约20cm直接照射1h；淹水（缺氧）：其根部完全没入无菌蒸馏水中，25℃24h；脱水（干旱）：淹水处理6h后移出，置于无菌滤纸上，继续25℃6h；复水：脱水处理后，加入无菌蒸馏水淹没其根部，继续25℃12h；真菌诱激子：含50mg•L-1酵母提取物的MS液体培养基中25℃培养7d；葡萄糖：含3%葡萄糖的MS液体培养基中25℃培养7d；高盐：含250 mmol•L-1 NaCl 的MS液体培养基中25℃培养7d；SA：含1 mmol•L-1SA的MS液体培养基中25℃培养7d；MJ：含100 μmol•L-1 MJ的MS液体培养基中25℃培养7d；对照：1/2MS固体培养基，25℃培养24 h或7 d。以上培养液均为pH7.0，培养条件光周期均为16 h光/8 h暗。
1.3 Dbr2基因的分离与序列分析 黄花蒿种子发芽培养30 d后取100 mg叶片提取总RNA并进行逆转录反应合成cDNA。根据文献[1]合成引物（Dbr2-1：5’-CACCATGTCTGAAAAACC AACCTTG-3’与Dbr2-2： 5’-GCTCATAAGATGC ACCTTAAT AAG-3’），扩增Dbr2基因编码序列。扩增条件为：98 ℃ 10 sec，45 ℃15 sec，72 ℃ 2 min，30个循环。1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化PCR产物，连接到pMD20-T载体并转化DH5，对经过酶切鉴定获得的阳性克隆由Invitrogen公司进行序列测定。
1.4 实时荧光定量PCR（RTFQ-PCR）检测 取各种诱导处理后的黄花蒿叶片100 mg ，提取总RNA并进行逆转录反应合成cDNA。以10倍稀释的cDNA为模板，actin基因为内参进行RTFQ-PCR反应检测Dbr2的转录水平，方法详见文献[2]。定量PCR引物根据相应的青蒿基因序列设计引物，分别为Dbr2-5：5’-CTCAAGGGGATGCTGATTTG-3’ 与Dbr2-6：5’-GGTAATC CGTGTACCCAACG-3’，扩增长度为150 bp；actin-5：5’-GCATCCCGTTCTTTTGACTG-3’与actin-6：5’-GCTCTGCTG TGGTGGTGAA-3’，扩增长度为317 bp。基因的相对转录水平以Dbr2 mRNA copies/actin mRNA copies表示。
1.5 统计学分析 实验中每个指标的测定均重复9个样本（n=9），每个样本测定均重复3次。数据采用SPSS13.0软件进行统计，采用配对t检验进行显著性分析。
2 结果
2.1 Dbr2基因的分离与序列分析 PCR扩增后的产物经回收后克隆于pMD20-T载体，取5个经过酶切鉴定的阳性克隆进行测序。测序结果显示，扩增片段编码序列长度为1179 bp，编码392个氨基酸。序列已上传GenBank，收录号为EU848577。序列比对分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）显示，该序列与番茄（GenBank收录号：AJ278332）、巴西橡胶树（GenBank收录号：DQ004685）、拟南芥（GenBank收录号：AF132212）等其他物种的二烯醇还原酶基因同源性为73%和68%，与GenBank收录的另一Dbr2 mRNA序列（收录号：EU704257）同源性为94.5%。两者由核苷酸推导的氨基酸序列同源性为94.6%，His239、Phe69与底物结合相关的氨基酸位点，以及His180 、His183、Tyr185与酶催化活性相关的氨基酸位点高度保守。本研究序列羧基末端（Ser-Arg-Leu）可能是过氧化物酶体定位点，且附近有一段N383-L389结构，而EU704257序列羧基末端替代为Ser-Leu-Leu，可能与不同亚细胞器定位有关。
2.2 胁迫条件下Dbr2基因的表达模式 采用RTFQ-PCR方法检测了Dbr2基因在多种人工模拟胁迫条件下的转录水平，得到Dbr2基因和内参actin基因的标准曲线方程及决定系数分别为：actin：Y = -3.609022X + 38.008945，R2 = 0.997841；Dbr2：Y = -3.678958X + 40.386537，R2 = 0.999076。黄花蒿无菌苗经过低温、紫外辐射、淹水、脱水、复水、真菌诱激子（酵母提取物）、葡萄糖、SA处理，Dbr2 mRNA水平分别提高2.5、3.7、10.8、6.0、34.5、28.7、6.3和8.5倍（P<0.01），其中水淹（缺氧）和真菌诱激对Dbr2基因转录刺激作用较大。而热休克、NaCl高盐和MJ处理后，Dbr2 mRNA水平与对照无显著差异（P>0.05）。
3 讨论
青蒿素的特异性生物合成从倍半萜共同前体法呢基焦磷酸（FPP）开始，FPP经黄花蒿所特有的紫穗槐二烯合酶（ADS）环化生成紫穗槐-4,11-二烯。从分子结构分析，紫穗槐二烯转化为双氢青蒿酸需经过C12位的氧化和C11-C13位的还原反应。C12位的氧化已知由细胞色素P450单加氧酶（CYP71AV1）
催化完成，Dbr2的发现使得C11-C13位的还原问题得到解答。本研究从黄花蒿中分离了Dbr2基因，由其核苷酸序列推导的氨基酸序列具有典型的二烯醇还原酶保守结构。不同地域或不同品系间，青蒿素生物合成相关基因（如ads、cyp71av1等）也会出现多态性现象，碱基和氨基酸序列会存在细小差异，至于这种差异是否会引起酶活性改变，从而影响青蒿素生物合成，目前还没有相关研究。
青蒿素作为一种次生代谢产物，外界条件刺激，包括低温、真菌感染及真菌诱激子、多糖、植物激素等都可以促进其合成[4]。有研究指出低温、水杨酸等条件刺激可通过上调青蒿素合成基因表达促进青蒿素前体合成和刺激产生活性氧促进青蒿素前体转化来提高青蒿素合成[5]。多个青蒿素生物合成相关基因（如hmgr、ads、cyp71av1等）已被证明具有发育和胁迫条件诱导表达特性，且与青蒿素生物合成呈正相关。进一步研究更发现，ads和cyp71av1基因启动子含有环境响应诱导元件，低温、紫外辐射、干旱等胁迫条件能刺激其调控基因高效表达[6]。本研究发现，作为青蒿素合成关键酶编码基因，Dbr2也同样具有诱导表达特性，对于低温、紫外辐射、淹水、脱水、复水、真菌诱激子、葡萄糖、SA刺激等多个人工模拟胁迫条件具有响应，mRNA水平普遍提高，其中对淹水（缺氧）、复水（干旱+缺氧）和真菌诱激子刺激响应更为明显。黄花蒿在世界范围分布广泛，但绝大多数地区黄花蒿中的青蒿素含量都很低，无生产利用价值。研究启发我们可以通过选用相应的胁迫条件，促进青蒿素合成基因表达，从而提高青素合成产量。
参考文献
[1] Zhang Y, Teoch KH, Reed DW, et al. The molecular cloning of artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase and its role in glandular trichome-dependent biosynthesis of artemisinin in Artemisia annua [J]. J Biol Chem, 2008, 283(31): 21501-21508
[2] Zeng QP, Zhao C, Yin L, et al. Cloning of artemisinin biosynthetic cDNAs and novel ESTs and quantification of low temperature-induced gene overexpression [J]. Sci China (Ser C), 2008, 51(3): 232-244
[3] 杨瑞仪, 杨雪芹, 冯丽玲. 青蒿素生物合成基因的转录谱分析[J]. 广州中医药大学学报, 2010, 27(4): 393-398
[4] Baldi A, Dixit VK. Yield enhancement strategies for artemisinin production by suspension cultures of Artemisia annua [J]. Bioresour Technol, 2008, 99(11): 4609-4614.
[5] Pu GB, Ma DM, Chen JL, et al. Salicylic acid activates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L [J]. Plant Cell Rep, 2009, 28(7): 1127-1135.
[6] 杨瑞仪, 杨雪芹, 冯丽玲等. 黄花蒿cyp71av1启动子的分离及表达特性分析[J]. 中草药, 2010, 42(4): 765-769.