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摘 要：目的：以中药溪黄草为研究对象，初步探明溪黄草发挥抑菌作用的药效物质基础。方法：本课题采用6种溶剂（蒸馏水、乙醇、乙醚、丙酮、甲醇和丁醇）提取溪黄草中的可溶出成分，分析比较不同提取液对大肠杆菌、黄曲霉菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果。 结果：溪黄草70% 乙醇提取液对大肠杆菌、黄曲霉菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，优于其他5种提取液（P <0. 05）。结论：溪黄草发挥抑菌作用的活性物质主要存在于乙醇提取物中， 预计溪黄草的抑菌作用能够在食品天然防腐剂、临床抗炎抑菌等方面有良好的应用前景和应用价值。
关键词：溪黄草 乙醇提取液 抑菌作用 物质基础
本次实验为探明溪黄草发挥抑菌抗菌作用的药效物质基础，对不同溶剂的溪黄草提取物进行了体外抑菌试验，以深入了解溪黄草提取物对各类微生物的抗菌作用，初步确定溪黄草中发挥抗炎抑菌作用的活性物质，为溪黄草提取物用于制备食物天然防腐剂和医疗抗菌药提供实验依据和数据支持。
一、材料與方法
1.仪器和材料。粉碎的干溪黄草（安国市御颜坊中药材有限公司），大肠杆菌、曲霉菌、金色葡萄球菌的菌种，LB培养基，查氏培养基，血琼脂平板培养基，肉汤培养基（连云港端峰生物科技有限公司），所有培养基均经170℃的干热灭菌2小时。
2.实验方法。
2.1水提取物 将干溪黄草尽量切碎，充分浸泡在蒸馏水中，煮沸三次后，将药液合并过滤除渣后，得到的纯净提取液进行减压浓缩操作，最后将制得的水提取物做好备注收好备用。
2.2其他提取物 将干溪黄草分别用浓度为70%的乙醇、乙醚、丙酮、甲醇和丁醇充分浸泡，得到的溪黄草提取液加入絮凝剂后过滤提纯、减压浓缩等处理，并将得到的乙醇提取物、甲醇提取物等备注好姓名收藏备用。
2.3制备含菌平板 在无菌操作环境中，将三种试验菌菌种移入相应的培养基内（大肠杆菌--LB培养基，黄曲霉菌--查氏培养基，金黄色葡萄球菌--血琼脂平板培养基），划线分离或涂布分离后，将LB培养基和血琼脂平板培养基放在培养箱中以37℃培养一小时，待其完全吸收后翻转培养基，使其倒置于培养箱内，在25℃下培养一周，或36±1℃下培养20-28小时；同样操作后将查氏培养基放于培养箱中以28℃培养2-3天。培养成功后所有培养基在0-4℃冷藏备用。
2.4测定抑菌圈直径。用灼烧后的无菌接种环挑取少量菌体于带玻璃珠的无菌生理盐水中，制成不同菌种的菌悬液，吸取适量菌悬液将细菌均匀密集的接种于培养基平皿上。无菌操作下将制备好的无菌滤纸小圆片分别浸泡于6种溪黄草提取液中，每种提取液设置三个浓度，浸泡好后用无菌镊子夹取圆片滤纸，等距离贴在刚刚制作的含菌培养基平板表面，最后将浸有生理盐水的对照滤纸片按上诉方法贴于培养基的中央部位，滤纸片放置后不可移动。不同的带菌培养基平板上贴好不同浓度、不同种类的溪黄草提取液滤纸片后，将培养基置于适宜温度下培养，带有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基在36±1℃下培养24h，黄曲霉菌培养基在28℃下培养48h，观察滤纸片周围抑菌圈的有无及大小，并测定抑菌圈的直径，以确定溪黄草提取物抑菌效果及最优提取方法。
2.5最小抑菌浓度和最小杀菌浓度 试管稀释法，取无菌试管6只，第一支加入1.8ml肉汤培养基，2-5加入1ml肉汤培养基。以无菌操作吸取已制备好的溪黄草乙醇提取液0.2ml加入第1支试管中，混匀后吸取1ml加入第2支试管中依次倍比稀释至第5管，第5管弃去1ml，第6管只加入1ml肉汤培养基作为对照管。每管加入1×105cfu大肠杆菌菌液0.1ml。在37℃培养18-24h后观察不同管内细菌生长现象。将实验重复3次，能够完全抑制大肠杆菌生长的最小药物浓度为最小抑菌浓度（MIC）。将溪黄草乙醇提取液的浓度高于MIC的试管继续培养一定时间，观察菌落生长情况，以仍无菌落生长的最小药物浓度为该提取物的最低杀菌浓度（MBC）。金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌也按照上述方法测定MIC和MBC，记录实验结果。
二、结果
1.溪黄草提取物的抑菌效果。由表1、表2、表3的实验数据比较可知，溪黄草提取物对大肠杆菌、曲霉菌、金色葡萄球菌均有抑菌作用，虽然不同提取剂提取的溪黄草对不同的细菌真菌抑菌作用并不相同，但通过综合比较发现用乙醇做提取剂，溪黄草提取物对三种试验菌的抑菌圈直径最大，抑菌效果最好，因此乙醇是提取溪黄草抑菌成分的最佳提取剂，溪黄草发挥抑菌作用主要药效成分存在于乙醇提取物中。
2.溪黄草提取物的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度。为了更准确的了解溪黄草提取物的抑菌效果，我们进一步测定了溪黄草乙醇提取物对试验菌的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），实验结果见表4。
由表4实验数据分析可知，不同浓度的溪黄草乙醇提取物对大肠杆菌、曲霉菌、金色葡萄球菌有不同的抑制作用，溪黄草乙醇提取物对大肠杆菌的MIC值、MBC值最小，抑菌、杀菌作用最明显；对金色葡萄球菌的抑菌、杀菌效果次之；对曲霉菌的最低抑菌浓度为0.5%，表明溪黄草提取物对曲霉菌的抑菌作用还是比较有效得。
三、结语
在本次实验中，溪黄草70%乙醇提取物对试验菌的抑菌作用优于其他溶剂提取物，说明溪黄草发挥抑菌作用主要药效成分存在于乙醇提取物中。溪黄草提取物对大肠杆菌、曲霉菌、金色葡萄球菌均有较好的抑菌作用，且其抑菌效果随着浓度的增加而逐渐增强，溪黄草乙醇提取物是一种抗炎抑菌的天然活性物质，以其作为原材料开发安全经济实用的新型抗菌药预计在医药、食品等方面的能取得广阔应用前景。
参考文献：
[1]刘方乐，陈德金，冯秀丽，吴冲，林朝展，祝晨蔯. 溪黄草的化学成分研究[J]. 中药新药与临床药理，2016，27（6）：242-245.
[2]郑琴，崔炯谟，傅宏征. 溪黄草的化学成分研究[J]. 中国中药杂志，2011，36（16）：2203-2206.
关键词：溪黄草 乙醇提取液 抑菌作用 物质基础
本次实验为探明溪黄草发挥抑菌抗菌作用的药效物质基础，对不同溶剂的溪黄草提取物进行了体外抑菌试验，以深入了解溪黄草提取物对各类微生物的抗菌作用，初步确定溪黄草中发挥抗炎抑菌作用的活性物质，为溪黄草提取物用于制备食物天然防腐剂和医疗抗菌药提供实验依据和数据支持。
一、材料與方法
1.仪器和材料。粉碎的干溪黄草（安国市御颜坊中药材有限公司），大肠杆菌、曲霉菌、金色葡萄球菌的菌种，LB培养基，查氏培养基，血琼脂平板培养基，肉汤培养基（连云港端峰生物科技有限公司），所有培养基均经170℃的干热灭菌2小时。
2.实验方法。
2.1水提取物 将干溪黄草尽量切碎，充分浸泡在蒸馏水中，煮沸三次后，将药液合并过滤除渣后，得到的纯净提取液进行减压浓缩操作，最后将制得的水提取物做好备注收好备用。
2.2其他提取物 将干溪黄草分别用浓度为70%的乙醇、乙醚、丙酮、甲醇和丁醇充分浸泡，得到的溪黄草提取液加入絮凝剂后过滤提纯、减压浓缩等处理，并将得到的乙醇提取物、甲醇提取物等备注好姓名收藏备用。
2.3制备含菌平板 在无菌操作环境中，将三种试验菌菌种移入相应的培养基内（大肠杆菌--LB培养基，黄曲霉菌--查氏培养基，金黄色葡萄球菌--血琼脂平板培养基），划线分离或涂布分离后，将LB培养基和血琼脂平板培养基放在培养箱中以37℃培养一小时，待其完全吸收后翻转培养基，使其倒置于培养箱内，在25℃下培养一周，或36±1℃下培养20-28小时；同样操作后将查氏培养基放于培养箱中以28℃培养2-3天。培养成功后所有培养基在0-4℃冷藏备用。
2.4测定抑菌圈直径。用灼烧后的无菌接种环挑取少量菌体于带玻璃珠的无菌生理盐水中，制成不同菌种的菌悬液，吸取适量菌悬液将细菌均匀密集的接种于培养基平皿上。无菌操作下将制备好的无菌滤纸小圆片分别浸泡于6种溪黄草提取液中，每种提取液设置三个浓度，浸泡好后用无菌镊子夹取圆片滤纸，等距离贴在刚刚制作的含菌培养基平板表面，最后将浸有生理盐水的对照滤纸片按上诉方法贴于培养基的中央部位，滤纸片放置后不可移动。不同的带菌培养基平板上贴好不同浓度、不同种类的溪黄草提取液滤纸片后，将培养基置于适宜温度下培养，带有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基在36±1℃下培养24h，黄曲霉菌培养基在28℃下培养48h，观察滤纸片周围抑菌圈的有无及大小，并测定抑菌圈的直径，以确定溪黄草提取物抑菌效果及最优提取方法。
2.5最小抑菌浓度和最小杀菌浓度 试管稀释法，取无菌试管6只，第一支加入1.8ml肉汤培养基，2-5加入1ml肉汤培养基。以无菌操作吸取已制备好的溪黄草乙醇提取液0.2ml加入第1支试管中，混匀后吸取1ml加入第2支试管中依次倍比稀释至第5管，第5管弃去1ml，第6管只加入1ml肉汤培养基作为对照管。每管加入1×105cfu大肠杆菌菌液0.1ml。在37℃培养18-24h后观察不同管内细菌生长现象。将实验重复3次，能够完全抑制大肠杆菌生长的最小药物浓度为最小抑菌浓度（MIC）。将溪黄草乙醇提取液的浓度高于MIC的试管继续培养一定时间，观察菌落生长情况，以仍无菌落生长的最小药物浓度为该提取物的最低杀菌浓度（MBC）。金黄色葡萄球菌和黄曲霉菌也按照上述方法测定MIC和MBC，记录实验结果。
二、结果
1.溪黄草提取物的抑菌效果。由表1、表2、表3的实验数据比较可知，溪黄草提取物对大肠杆菌、曲霉菌、金色葡萄球菌均有抑菌作用，虽然不同提取剂提取的溪黄草对不同的细菌真菌抑菌作用并不相同，但通过综合比较发现用乙醇做提取剂，溪黄草提取物对三种试验菌的抑菌圈直径最大，抑菌效果最好，因此乙醇是提取溪黄草抑菌成分的最佳提取剂，溪黄草发挥抑菌作用主要药效成分存在于乙醇提取物中。
2.溪黄草提取物的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度。为了更准确的了解溪黄草提取物的抑菌效果，我们进一步测定了溪黄草乙醇提取物对试验菌的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），实验结果见表4。
由表4实验数据分析可知，不同浓度的溪黄草乙醇提取物对大肠杆菌、曲霉菌、金色葡萄球菌有不同的抑制作用，溪黄草乙醇提取物对大肠杆菌的MIC值、MBC值最小，抑菌、杀菌作用最明显；对金色葡萄球菌的抑菌、杀菌效果次之；对曲霉菌的最低抑菌浓度为0.5%，表明溪黄草提取物对曲霉菌的抑菌作用还是比较有效得。
三、结语
在本次实验中，溪黄草70%乙醇提取物对试验菌的抑菌作用优于其他溶剂提取物，说明溪黄草发挥抑菌作用主要药效成分存在于乙醇提取物中。溪黄草提取物对大肠杆菌、曲霉菌、金色葡萄球菌均有较好的抑菌作用，且其抑菌效果随着浓度的增加而逐渐增强，溪黄草乙醇提取物是一种抗炎抑菌的天然活性物质，以其作为原材料开发安全经济实用的新型抗菌药预计在医药、食品等方面的能取得广阔应用前景。
参考文献：
[1]刘方乐，陈德金，冯秀丽，吴冲，林朝展，祝晨蔯. 溪黄草的化学成分研究[J]. 中药新药与临床药理，2016，27（6）：242-245.
[2]郑琴，崔炯谟，傅宏征. 溪黄草的化学成分研究[J]. 中国中药杂志，2011，36（16）：2203-2206.