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摘 要 硫醇是橡胶树胶乳中重要的抗氧化剂，半胱氨酸是硫醇合成的前体，亚硫酸盐还原酶在半胱氨酸合成过程中起重要作用。从橡胶树中克隆编码铁氧还型亚硫酸盐还原酶的cDNA。结果表明：该cDNA全长2 417 bp，包含2 070 bp的开放阅读框、183 bp的5′UTR和164 bp的3′UTR，命名为HbSiR（GenBank： KF765492）。组织表达分析结果显示：HbSiR在橡胶树的根、叶、木质部、树皮及胶乳均有表达；在‘热研8-79’的胶乳中HbSiR基因的表达量高于‘PR107’胶乳中的表达量，但随着排胶时间的延长，‘热研8-79’和‘PR107’胶乳中HbSiR的表达量均降低。初步推测HbSiR与胶乳硫醇的含量有关。
关键词 亚硫酸盐还原酶基因；橡胶树；硫醇
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Cloning and Expression Analysis of HbSiR from
Rubber Tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg）
WEI Fang1，ZHENG Qiankun2，LUO Shiqiao1，QIU Jian1，YANG Wenfeng1，
WANG Qichao2， WU Ming1， XIAO Xianzhou1*
1 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Biology
and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China
2 College of Agrinomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract Thiols is an important antioxidant to laticifer sub-membrane in rubber tree latex. Cysteine is the precursor of thiols for the synthesis of methionine， glutathione and so on. Sulfite reductase（SiR） is an important enzyme for cysteine biosynthesis. A full-length cDNA coding ferredoxin-sulfite reductase from rubber tree， named HbSiR（GenBank： KF765492）， was isolated for the first time. The cDNA was 2 417 bp long， containing a 183 bp 5′UTR， a 164 bp 3′UTR and a 2 070 bp open reading frame. Analysis of expression indicated it is a constitutive gene， and the levels of gene expression was higher in Reyan 8-79 than in PR107 latex， following latex flow， the expression reduced. That inferred HbSiR is related with thiol contents in rubber tree latex.
Key words Sulfite reductase；Hevea brasiliensis；Thiols
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.008
硫醇是橡胶树乳管亚细胞膜非酶促防御系统的重要抗氧化剂，胶乳中的硫醇包括谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸等，可抵御由于逆境和衰老所产生的活性氧的毒害，是乳管的保护因子和胶乳的稳定剂之一。在无机硫同化过程中，硫酸盐从进入细胞到固定为有机硫化物有一套完整协同的路径，前期的研究结果证明，橡胶树胶乳中存在完整的硫同化途径，首先，在质子浓度差作用下，以硫转运蛋白（Sulfate transporter）为载体使硫酸盐进入胞内[1]，其次在ATP活化能推动下依赖ATP硫酸化酶催化硫酸盐生成腺苷-5，-磷酰硫酸（adenosine 5，-phosphosulfate， APS）， APS激酶（APS kinase， APK）与APS还原酶（APS reductase， APR）进一步还原，生成半胱氨酸。植物以半胱氨酸为前体，合成众多具有重要生物学功能的代谢产物，直接关系到植物的逆境胁迫[2]。通过拟南芥同位素标记跟踪发现，在整个硫酸盐还原路径中，APR有最强的控制力[3]，且对硫酸盐含量的变化具有关键作用[4]。
与APR相比，硫酸盐还原路径中另外一个还原酶——亚硫酸盐还原酶（Sulfite reductase， SiR，EC1.8.7.1）很少引起重视，而近期研究结果证明，SiR在半胱氨酸合成代谢中有控制作用[5]。植物SiR是一种定位质体的可溶性蛋白，SiR负责将APR还原后产生的亚硫酸盐进一步还原。在拟南芥、水稻及其他多个物种中，硫还原途径中多数基因以家族方式存在，而拟南芥中SiR是该途径中唯一一个单一基因编码的蛋白，近期通过插入突变和同位素标记研究结果发现，SiR活力降低导致进入半胱氨酸和谷胱甘肽的硫含量显著减低，同时，SiR活性的变化引起了硫酸盐同化的主要路径和次要路径适应性的变化，该研究结果认为以上证据预示了SiR是硫酸盐同化途径中很重要的瓶颈之一[5]。在拟南芥中以单基因存在，可以预测其下调表达，将会严重影响硫同化速率，而橡胶树需要大量还原性的硫，尤其是胶乳中，还原硫用于应对割胶和排胶产生的活性氧及补充随胶乳排出的硫醇化合物， 是橡胶树硫醇合成过程中的重要酶。作为橡胶树胶乳硫醇合成代谢研究的一部分内容，本研究报道了橡胶树SiR的一个cDNA序列，并分析橡胶树胶乳和其他组织中的表达特点，并对胶乳硫醇存在显著差异的2个橡胶树无性系的胶乳转录表达进行了研究，以期更好的理解亚硫酸盐还原酶在胶乳硫醇合成中的作用。 1 材料与方法
1.1 材料
橡胶树（Hevea brasiliensis Müell. Arg.）无性系‘热研8-33-97’、‘热研8-79’和‘PR107’选自中国热带农业科学院试验场三队。RNA提取试剂盒购自百泰克公司，凝胶回收试剂盒购自Axygen公司，反转录酶购自Takara Primescript Reverse Transcriptase，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及反转录 提取巴西橡胶树无性系‘热研8-33-97’的根、茎、叶胶乳混合RNA，采用紫外分光光度计检测RNA的纯度并测定浓度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，反转录后用内参基因18s rRNA的引物18s-F和18s-R进行PCR检测纯度。
1.2.2 基因克隆 以cDNA为模板，SiR-F和SiR-R为引物，利用PCR扩增已知的EST序列。PCR反应体系共为25 μL，其中包含1×PCR buffer，200 μmol/L dNTPs，200 ng引物，3 μg cDNA 和1.5 U Taq DNA聚合酶。反应程序为：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2.5 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min；1%琼脂糖凝胶电泳检测。通过RACE技术扩增基因的全长，末端加尾酶为Takara公司，接头引物序列分别为：AUAP和AAP，5′RACE引物有SiR-a-1、SiR-a-2、SiR-a-3，全长引物有SiR-qF和SiR-qR（见表1）。扩增得到的电泳序列经过凝胶回收试剂盒（Axygen）纯化回收后连接到pMD 18-T（Takara）载体上，并送上海英俊生物技术有限公司测序。
1.2.3 序列分析及功能预测 利用Clustal1.83软件分析该序列编码氨基酸和其他植物比较分析。用TargetP进行亚细胞定位预测分析。
1.2.4 表达分析 提取橡胶树根、茎、叶胶乳RNA，调整RNA浓度，反转录为cDNA；提取橡胶树开割3 a无性系‘热研8-79’和‘PR107’割胶后不同时间段胶乳RNA，调整RNA浓度，反转录为cDNA。以18s为引物，利用PCR扩增检测cDNA的完整性，并利用2%琼脂糖凝胶电泳调整浓度，使各个cDNA模板量一致。用调整好的cDNA模板检测SiR基因的表达，引物序列为SiR-QF和SiR-QR。
2 结果与分析
2.1 HbSiR基因的序列分析
根据已知的EST序列，5′RACE结果得到N端非翻译区183 bp，电子克隆拼接后C端非翻译区164 bp，经SiR-qf、SiR-qR引物验证后，命名为HbSiR，该序列具有完整的开放阅读框，GenBank登陆号：KF765492。HbSiR经GenBank比对后，该序列与蓖麻亚硫酸盐还原酶基因（XM_002513449.1）的相似度为89%。
2.2 氨基酸序列分析
根据核苷酸序列推导，HbSiR基因序列编码689个氨基酸，预测其蛋白分子量为70 ku，与其他几种植物比较具有高度保守性（图1）。用TargetP软件分析预测，推导该氨基酸序列极有可能定位于叶绿体，且没有信号肽存在，不属于分泌蛋白。同时该氨基酸序列也不存在单子叶N端特异的EVKRSKVEI序列，与拟南芥比较发现，推导的氨基酸序列也有4个保守半胱氨酸残基（Cys499、Cys505、Cys545、Cy549）和组成氢键网的4个氨基酸残基（Arg130、Arg199、Lys281、Lys283）。另外，HbSiR还存在铁硫簇结合位点。
系统树构建分析结果发现， 与水稻（Oryza sativa AAU90241.1）、蓖麻（Ricinus communis XP_002513495.1）、 玉米（Zea mays BAA23641.1）、烟草（Nicotiana tabacum BAA33531.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana CAA89154.1）、 鱼腥藻（Anabaena variabilis ABA24640.1）、 芦笋（Asparagus officinalis ABB55339.1）、 二穗短柄草（Brachypodium distachyon XP_003568157.1）、 大豆（Glycine max XP_003540209.1）、甘紫菜（Porphyra purpurea AAP97125.1）、豌豆（Pisum sativum BAD12837.2）、西红柿（Solanum lycopersicum AFB83709.1）和葡萄（Vitis vinifera XP_002285398.1）进行比较，结果显示HbSiR与双子叶植物的亲缘关系较近，尤其是同属大戟科的蓖麻，而与几个禾本科的单子叶植物的亲缘关系较远（图2）。亚硫酸盐还原酶与同科植物之间关系较近，双子叶植物与单子叶植物之间关系较远的结果，与McManus等[6]的研究结果相同。
2.3 组织表达分析
在橡胶树根、叶、木质部、树皮及胶乳中均检测到了HbSiR基因的表达，说明该基因属于组成型表达，但其表达量在不同组织中不一样，胶乳中表达量最低，木质部和树皮中表达量较高（图3）。
2.4 不同排胶时间表达分析
橡胶树无性系‘热研8-79’胶乳硫醇含量高于‘PR107’[7]，在胶乳硫醇含量存在显著差异的这2个无性系的不同排胶时间均检测到HbSiR基因的表达，说明HbSiR基因与硫醇的含量有关。半定量表达结果表明，在表达趋势方面，排胶初始阶段，HbSiR基因表达量较高，随着排胶时间的延长，胶乳中HbSiR基因的表达量降低，甚至‘PR107’在排胶30 min后未检测到表达；2个无性系之间进行比较，结果显示‘热研8-79’排胶过程的各个阶段胶乳中HbSiR基因的表达均高于‘PR107’。统计学分析结果表明，在排胶的各个时期，2个无性系之间HbSiR基因的表达差异显著（图4）。
关键词 亚硫酸盐还原酶基因；橡胶树；硫醇
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Cloning and Expression Analysis of HbSiR from
Rubber Tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg）
WEI Fang1，ZHENG Qiankun2，LUO Shiqiao1，QIU Jian1，YANG Wenfeng1，
WANG Qichao2， WU Ming1， XIAO Xianzhou1*
1 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Biology
and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China
2 College of Agrinomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract Thiols is an important antioxidant to laticifer sub-membrane in rubber tree latex. Cysteine is the precursor of thiols for the synthesis of methionine， glutathione and so on. Sulfite reductase（SiR） is an important enzyme for cysteine biosynthesis. A full-length cDNA coding ferredoxin-sulfite reductase from rubber tree， named HbSiR（GenBank： KF765492）， was isolated for the first time. The cDNA was 2 417 bp long， containing a 183 bp 5′UTR， a 164 bp 3′UTR and a 2 070 bp open reading frame. Analysis of expression indicated it is a constitutive gene， and the levels of gene expression was higher in Reyan 8-79 than in PR107 latex， following latex flow， the expression reduced. That inferred HbSiR is related with thiol contents in rubber tree latex.
Key words Sulfite reductase；Hevea brasiliensis；Thiols
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.008
硫醇是橡胶树乳管亚细胞膜非酶促防御系统的重要抗氧化剂，胶乳中的硫醇包括谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸等，可抵御由于逆境和衰老所产生的活性氧的毒害，是乳管的保护因子和胶乳的稳定剂之一。在无机硫同化过程中，硫酸盐从进入细胞到固定为有机硫化物有一套完整协同的路径，前期的研究结果证明，橡胶树胶乳中存在完整的硫同化途径，首先，在质子浓度差作用下，以硫转运蛋白（Sulfate transporter）为载体使硫酸盐进入胞内[1]，其次在ATP活化能推动下依赖ATP硫酸化酶催化硫酸盐生成腺苷-5，-磷酰硫酸（adenosine 5，-phosphosulfate， APS）， APS激酶（APS kinase， APK）与APS还原酶（APS reductase， APR）进一步还原，生成半胱氨酸。植物以半胱氨酸为前体，合成众多具有重要生物学功能的代谢产物，直接关系到植物的逆境胁迫[2]。通过拟南芥同位素标记跟踪发现，在整个硫酸盐还原路径中，APR有最强的控制力[3]，且对硫酸盐含量的变化具有关键作用[4]。
与APR相比，硫酸盐还原路径中另外一个还原酶——亚硫酸盐还原酶（Sulfite reductase， SiR，EC1.8.7.1）很少引起重视，而近期研究结果证明，SiR在半胱氨酸合成代谢中有控制作用[5]。植物SiR是一种定位质体的可溶性蛋白，SiR负责将APR还原后产生的亚硫酸盐进一步还原。在拟南芥、水稻及其他多个物种中，硫还原途径中多数基因以家族方式存在，而拟南芥中SiR是该途径中唯一一个单一基因编码的蛋白，近期通过插入突变和同位素标记研究结果发现，SiR活力降低导致进入半胱氨酸和谷胱甘肽的硫含量显著减低，同时，SiR活性的变化引起了硫酸盐同化的主要路径和次要路径适应性的变化，该研究结果认为以上证据预示了SiR是硫酸盐同化途径中很重要的瓶颈之一[5]。在拟南芥中以单基因存在，可以预测其下调表达，将会严重影响硫同化速率，而橡胶树需要大量还原性的硫，尤其是胶乳中，还原硫用于应对割胶和排胶产生的活性氧及补充随胶乳排出的硫醇化合物， 是橡胶树硫醇合成过程中的重要酶。作为橡胶树胶乳硫醇合成代谢研究的一部分内容，本研究报道了橡胶树SiR的一个cDNA序列，并分析橡胶树胶乳和其他组织中的表达特点，并对胶乳硫醇存在显著差异的2个橡胶树无性系的胶乳转录表达进行了研究，以期更好的理解亚硫酸盐还原酶在胶乳硫醇合成中的作用。 1 材料与方法
1.1 材料
橡胶树（Hevea brasiliensis Müell. Arg.）无性系‘热研8-33-97’、‘热研8-79’和‘PR107’选自中国热带农业科学院试验场三队。RNA提取试剂盒购自百泰克公司，凝胶回收试剂盒购自Axygen公司，反转录酶购自Takara Primescript Reverse Transcriptase，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及反转录 提取巴西橡胶树无性系‘热研8-33-97’的根、茎、叶胶乳混合RNA，采用紫外分光光度计检测RNA的纯度并测定浓度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，反转录后用内参基因18s rRNA的引物18s-F和18s-R进行PCR检测纯度。
1.2.2 基因克隆 以cDNA为模板，SiR-F和SiR-R为引物，利用PCR扩增已知的EST序列。PCR反应体系共为25 μL，其中包含1×PCR buffer，200 μmol/L dNTPs，200 ng引物，3 μg cDNA 和1.5 U Taq DNA聚合酶。反应程序为：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2.5 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min；1%琼脂糖凝胶电泳检测。通过RACE技术扩增基因的全长，末端加尾酶为Takara公司，接头引物序列分别为：AUAP和AAP，5′RACE引物有SiR-a-1、SiR-a-2、SiR-a-3，全长引物有SiR-qF和SiR-qR（见表1）。扩增得到的电泳序列经过凝胶回收试剂盒（Axygen）纯化回收后连接到pMD 18-T（Takara）载体上，并送上海英俊生物技术有限公司测序。
1.2.3 序列分析及功能预测 利用Clustal1.83软件分析该序列编码氨基酸和其他植物比较分析。用TargetP进行亚细胞定位预测分析。
1.2.4 表达分析 提取橡胶树根、茎、叶胶乳RNA，调整RNA浓度，反转录为cDNA；提取橡胶树开割3 a无性系‘热研8-79’和‘PR107’割胶后不同时间段胶乳RNA，调整RNA浓度，反转录为cDNA。以18s为引物，利用PCR扩增检测cDNA的完整性，并利用2%琼脂糖凝胶电泳调整浓度，使各个cDNA模板量一致。用调整好的cDNA模板检测SiR基因的表达，引物序列为SiR-QF和SiR-QR。
2 结果与分析
2.1 HbSiR基因的序列分析
根据已知的EST序列，5′RACE结果得到N端非翻译区183 bp，电子克隆拼接后C端非翻译区164 bp，经SiR-qf、SiR-qR引物验证后，命名为HbSiR，该序列具有完整的开放阅读框，GenBank登陆号：KF765492。HbSiR经GenBank比对后，该序列与蓖麻亚硫酸盐还原酶基因（XM_002513449.1）的相似度为89%。
2.2 氨基酸序列分析
根据核苷酸序列推导，HbSiR基因序列编码689个氨基酸，预测其蛋白分子量为70 ku，与其他几种植物比较具有高度保守性（图1）。用TargetP软件分析预测，推导该氨基酸序列极有可能定位于叶绿体，且没有信号肽存在，不属于分泌蛋白。同时该氨基酸序列也不存在单子叶N端特异的EVKRSKVEI序列，与拟南芥比较发现，推导的氨基酸序列也有4个保守半胱氨酸残基（Cys499、Cys505、Cys545、Cy549）和组成氢键网的4个氨基酸残基（Arg130、Arg199、Lys281、Lys283）。另外，HbSiR还存在铁硫簇结合位点。
系统树构建分析结果发现， 与水稻（Oryza sativa AAU90241.1）、蓖麻（Ricinus communis XP_002513495.1）、 玉米（Zea mays BAA23641.1）、烟草（Nicotiana tabacum BAA33531.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana CAA89154.1）、 鱼腥藻（Anabaena variabilis ABA24640.1）、 芦笋（Asparagus officinalis ABB55339.1）、 二穗短柄草（Brachypodium distachyon XP_003568157.1）、 大豆（Glycine max XP_003540209.1）、甘紫菜（Porphyra purpurea AAP97125.1）、豌豆（Pisum sativum BAD12837.2）、西红柿（Solanum lycopersicum AFB83709.1）和葡萄（Vitis vinifera XP_002285398.1）进行比较，结果显示HbSiR与双子叶植物的亲缘关系较近，尤其是同属大戟科的蓖麻，而与几个禾本科的单子叶植物的亲缘关系较远（图2）。亚硫酸盐还原酶与同科植物之间关系较近，双子叶植物与单子叶植物之间关系较远的结果，与McManus等[6]的研究结果相同。
2.3 组织表达分析
在橡胶树根、叶、木质部、树皮及胶乳中均检测到了HbSiR基因的表达，说明该基因属于组成型表达，但其表达量在不同组织中不一样，胶乳中表达量最低，木质部和树皮中表达量较高（图3）。
2.4 不同排胶时间表达分析
橡胶树无性系‘热研8-79’胶乳硫醇含量高于‘PR107’[7]，在胶乳硫醇含量存在显著差异的这2个无性系的不同排胶时间均检测到HbSiR基因的表达，说明HbSiR基因与硫醇的含量有关。半定量表达结果表明，在表达趋势方面，排胶初始阶段，HbSiR基因表达量较高，随着排胶时间的延长，胶乳中HbSiR基因的表达量降低，甚至‘PR107’在排胶30 min后未检测到表达；2个无性系之间进行比较，结果显示‘热研8-79’排胶过程的各个阶段胶乳中HbSiR基因的表达均高于‘PR107’。统计学分析结果表明，在排胶的各个时期，2个无性系之间HbSiR基因的表达差异显著（图4）。