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【摘要】细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元，在单细胞水平上对细胞进行研究可以获得反映细胞生理状态和过程的更准确、更全面的信息。由于微流控芯片的微米级尺寸通道及网络式结构，在芯片上从事单细胞分析发展十分迅速。本文简要介绍了近年微流控芯片在细胞培养、操纵、溶膜、组分检测等方面的应用。
【关键词】微流控芯片；细胞培养；操纵；溶膜；组分检测
1 前言
细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元，各种生命运动都是在细胞内实现的。细胞的异质性使细胞在化学组成、生理响应等方面存在着差异，因此在单细胞水平上研究细胞将人们对细胞的认识提升到更清晰的层次[1]。单细胞分析更注重细胞个体差异，可以检测到群体分析获得的平均结果掩盖掉的重要信息，这对于疾病早期诊断和预防是非常重要的。
微全分析系统的概念自1990年Manz[2]首次提出后，在短短十余年已进入世界最前沿的科技领域。它是把生物化学等领域所涉及的样品制备，生物化学反应，分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术[3]。
微流控芯片在细胞研究方面具有以下优势：微米级通道与细胞具有尺度相容性；可与相关分析仪器集成；具有网络式结构，容易操纵细胞；平板式几何构型，方便对细胞进行观察。
自1997年Li等[4]首次在芯片上实现单细胞的操纵以来, 许多分析工作者致力于这一领域的研究。本文主要对近些年来芯片在细胞培养、细胞操纵、细胞溶膜、细胞组分分析等方面的应用进行了综述。
2 微流控芯片在细胞研究中的应用
2.1 细胞培养
微加工技术发展为芯片在液流控制，细胞生理环境的模拟及高通量加工等提供了很大的优势[5]，芯片常用的细胞培养方法是灌流式培养。Tourovskaia等[6]设计了一种能长时间维持心肌细胞生长的微流控灌流系统，实现了细胞由成肌细胞到多核肌纤维的分化。Gottwald等[7]开发了一种多功能三维组织培养装置，它能根据特定的细胞类型，通过合适的通道修饰调整细胞培养环境。该装置能提供胚胎癌细胞和胚胎干细胞中胚层分裂所需的生长环境。
2.2细胞操纵
芯片细胞分析中非常关键的一步是在分析之前如何重现性的将细胞远送到预定位点，它包括从细胞群体中目标细胞的分离筛选和捕获。目前在芯片上进行细胞操纵的方法主要有:机械操纵法、介电电泳法、光学操纵法、电操纵法和磁操纵法等。
2.2.1机械力操纵
机械力操纵法主要是指利用微机械加工技术, 在芯片上刻蚀出各种结构,根据细胞尺寸的差异进行物理分离的一种方法。黄等[8]设计了一种芯片结构。上层是加工了微通道的PDMS，下层是刻蚀了微坑的玻璃。以静压力流驱动单PC12细胞进行传输和定位，由另一通道引入尼古丁刺激剂，以低噪声碳纤维电极实时监测了细胞神经递质多巴胺的量子释放。
2.2.2光学操纵
光学操纵是指当光束照射对细胞产生作用力, 细胞被捕获后在这个力作用下被运送到目标检测分析位置。它能实现无接触式操纵、不损伤细胞，但设备昂贵。Wakamoto等[9]在芯片上用激光镊子将细胞从培养微室转移到分析微室，或从分析微室转移到废液微室。可以去除基因变异的细胞，实现细胞的纯化。 Kamlesh等[10]设计了一种微流控芯片荧光激发细胞分选装置。细胞在经过静压力聚焦之后，在经过激光检测为目标细胞后，目标细胞在近红外激光作用下偏移至收集池。
2.2.3 电场力操纵
电场力操纵技术具有高速、灵活、可控性强、易于实现自动化等优点。Yasukawa等[11]设计了一种用于电泳操纵细胞的微流控装置。在刻蚀在玻璃底片的分析微室中沉积两个微型电极，作为电泳操纵细胞和电化学检测的工作电极。携带β-半乳糖苷酶报告基因的酵母细胞进入分析微室引发基因表达，产物催化对氨基苯-β-D-半乳糖苷水解，产生电活性物质对氨基苯苯酚以完成电化学检测。Miiller等[12]设计了具有三维结构的微电极阵列，采用阴极介电电泳技术(DEP)实现了真核细胞的聚焦、捕获和分离等功能。
2.2.4 磁力操纵法
Harrison等[13]设计了一种磁分选细胞装置。结合了抗人CD3的蛋白质修饰的顺磁性磁珠进入通道后被外加磁铁产生的磁场捕获固定在芯片上，引入血液样品后抗人CD3分子与T细胞表面的抗原受体紧密结合，借助磁场收集T细胞。磁力方法可手动完成，不需要昂贵仪器，对细胞损伤小。
2.3 细胞溶膜
细胞溶膜是进行细胞组分分析的重要步骤。目前基于芯片的细胞溶膜方法主要有化学试剂溶膜法、电场溶膜法、电泳缓冲液溶膜法、机械溶膜法等。
2.3.1 化学试剂溶膜法
常见的化学溶膜剂主要有十二烷基磺酸钠、毛地黄皂苷、强碱如NaOH等。Lee等[14]设计了一种新颖的芯片在线溶膜方法。由电极产生的OH-进入细胞膜，诱使细胞溶膜。溶膜完毕之后，芯片电极上产生H+中和多余的OH-，无需另外的清洗步骤。他们又对仓鼠细胞、红细胞等进行了溶膜实验，并且对其细胞胞液进行了分析测定。
2.3.2 电溶膜法
Ramsey小组[15]采用高频振荡电压使细胞破碎，同时在另一通道中加乳化剂溶解细胞碎片，交变电场的使用降低了焦耳热，能够在33 ms内完成细胞的溶膜。
2.3.4 机械力裂解溶膜法
Carlo等[16]发展了一种利用机械力裂解细胞的微流控芯片装置。其中的微流控细胞过滤区域集中了大量的纳米尺寸的尖刺，当细胞接触这些尖刺后被机械力裂解。
2.4 细胞组分分析
细胞内组分复杂, 对细胞内成分的分析和测定对于研究体内细胞代谢过程、信号转导等具有重大的意义。
Ramsey小组[17]在微流控芯片上实现了单细胞内标记染料的分离及检测。其做法是先使染料自由渗透进入细胞内部，再将细胞溶膜，然后进行芯片毛细管电泳分离。Zare研究组[18]将细胞分析的全部步骤集成在了微流控芯片上,包括细胞操纵、试剂引入及运输、细胞裂解、胞内氨基酸荧光标记、电泳分离及LIF检测实现了6种氨基酸的分离检测。最近,他们[19]又以类似的方法测定了单个昆虫细胞中的低拷贝蛋白数。
3发展前景
随着纳米技术材料的出现、微加工技术的发展和电化学、光学和计算机等学科的介入, 微流控芯片在细胞方面的应用朝着微型化、集成化、高灵敏度及高通量的方向发展。可以展望芯片在细胞分析领域的应用将越来越广阔。
【参考文献】
[1] Gallet, F, etal. Biologie Clinique. 2004 , 62: 85-86.
[2] Manz, A, Graber, N, etal. Sens. Actuators, B. 1990, B: 244-248.
[3] 林炳承,中国药科大学学报, 2003，34, 1：1-6.
[4] Li, P.C., and Harrison, D.J. Anal. Chem. 1997, 69: 1564-1568.
[5] P.J. Hung, P.J. Lee, etal. Biotechnol. Bioeng. 2005，89: 1-8.
[6] A. Tourovskaia, etal. Lab Chip. 2005, 5: 14-19.
[7] E. Gottwald, etal. Lab Chip. 2007, 7: 777-785.
[8] Huang, W. H, Cheng, J. K, etal. Anal. Chem. 2004, 76: 483-486.
[9] Wakamoto, Y, etal. Fresenius J. Anal. Chem. 2001, 371: 276-281.
[10] Thomas D. Perroud, etal. Anal. Chem. 2008, 80: 6365-6372.
[11] Yasukawa T, etal. Anal. Chem. 2008, 80: 3722-3727.
[12] Miiller T, Gradl G, et al. Biosens. Bioelectron. 1999, 14: 247-256
[13] Vasile I. Furdui, etal. Lab Chip, 2004, 4: 614-618.
[14] Carlo, D. D, Lee, L. P. Lab Chip. 2005, 5: 171-178.
[15] Culbertson, C. T, etal. Anal. Chem. 2003, 75: 5646-5655.
[16] Carlo,D. D, etal. Lab.Chip. 2003, 3: 287-291.
[17] McClain M A, et a1. Anal Chem, 2003, 75: 5646-5655.
[18] Wu H,etal.Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 2004,101：12809-12813
[19] Huang B et al. Science, 2007, 315: 81-84.
The Studies on Single Cell Based on a Microchip
Xiaocong Gong＊Qingling LiBo TangHongbo Zhong
(College of Chemistry, Chemical Engineering and Materials Science, Key Laboratory of Molecular and Nano Probes, Ministry of Education, Shandong Normal University, Jinan, 250014)
【Abstract】Cells are fundamental unit of morphological configuration and vital activity of organisms. Studies on single cell will obtain more accurate and general information about the physical state and progress. Due to micron level dimension and network configuration, the studies on single cells on a microfluidic chip have made significant development. In this article, the applications of microchip on cell culture, manipulation, lysis and analysis are reviewed.
【Keywords】microfluidic chip; cell culture; cell manipulation; cell lysis, cell analysis
作者简介：
公晓聪（1982.1--），女，山东省临沂市人, 山东师范大学化学化工与材料科学学院,分析化学
【关键词】微流控芯片；细胞培养；操纵；溶膜；组分检测
1 前言
细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元，各种生命运动都是在细胞内实现的。细胞的异质性使细胞在化学组成、生理响应等方面存在着差异，因此在单细胞水平上研究细胞将人们对细胞的认识提升到更清晰的层次[1]。单细胞分析更注重细胞个体差异，可以检测到群体分析获得的平均结果掩盖掉的重要信息，这对于疾病早期诊断和预防是非常重要的。
微全分析系统的概念自1990年Manz[2]首次提出后，在短短十余年已进入世界最前沿的科技领域。它是把生物化学等领域所涉及的样品制备，生物化学反应，分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术[3]。
微流控芯片在细胞研究方面具有以下优势：微米级通道与细胞具有尺度相容性；可与相关分析仪器集成；具有网络式结构，容易操纵细胞；平板式几何构型，方便对细胞进行观察。
自1997年Li等[4]首次在芯片上实现单细胞的操纵以来, 许多分析工作者致力于这一领域的研究。本文主要对近些年来芯片在细胞培养、细胞操纵、细胞溶膜、细胞组分分析等方面的应用进行了综述。
2 微流控芯片在细胞研究中的应用
2.1 细胞培养
微加工技术发展为芯片在液流控制，细胞生理环境的模拟及高通量加工等提供了很大的优势[5]，芯片常用的细胞培养方法是灌流式培养。Tourovskaia等[6]设计了一种能长时间维持心肌细胞生长的微流控灌流系统，实现了细胞由成肌细胞到多核肌纤维的分化。Gottwald等[7]开发了一种多功能三维组织培养装置，它能根据特定的细胞类型，通过合适的通道修饰调整细胞培养环境。该装置能提供胚胎癌细胞和胚胎干细胞中胚层分裂所需的生长环境。
2.2细胞操纵
芯片细胞分析中非常关键的一步是在分析之前如何重现性的将细胞远送到预定位点，它包括从细胞群体中目标细胞的分离筛选和捕获。目前在芯片上进行细胞操纵的方法主要有:机械操纵法、介电电泳法、光学操纵法、电操纵法和磁操纵法等。
2.2.1机械力操纵
机械力操纵法主要是指利用微机械加工技术, 在芯片上刻蚀出各种结构,根据细胞尺寸的差异进行物理分离的一种方法。黄等[8]设计了一种芯片结构。上层是加工了微通道的PDMS，下层是刻蚀了微坑的玻璃。以静压力流驱动单PC12细胞进行传输和定位，由另一通道引入尼古丁刺激剂，以低噪声碳纤维电极实时监测了细胞神经递质多巴胺的量子释放。
2.2.2光学操纵
光学操纵是指当光束照射对细胞产生作用力, 细胞被捕获后在这个力作用下被运送到目标检测分析位置。它能实现无接触式操纵、不损伤细胞，但设备昂贵。Wakamoto等[9]在芯片上用激光镊子将细胞从培养微室转移到分析微室，或从分析微室转移到废液微室。可以去除基因变异的细胞，实现细胞的纯化。 Kamlesh等[10]设计了一种微流控芯片荧光激发细胞分选装置。细胞在经过静压力聚焦之后，在经过激光检测为目标细胞后，目标细胞在近红外激光作用下偏移至收集池。
2.2.3 电场力操纵
电场力操纵技术具有高速、灵活、可控性强、易于实现自动化等优点。Yasukawa等[11]设计了一种用于电泳操纵细胞的微流控装置。在刻蚀在玻璃底片的分析微室中沉积两个微型电极，作为电泳操纵细胞和电化学检测的工作电极。携带β-半乳糖苷酶报告基因的酵母细胞进入分析微室引发基因表达，产物催化对氨基苯-β-D-半乳糖苷水解，产生电活性物质对氨基苯苯酚以完成电化学检测。Miiller等[12]设计了具有三维结构的微电极阵列，采用阴极介电电泳技术(DEP)实现了真核细胞的聚焦、捕获和分离等功能。
2.2.4 磁力操纵法
Harrison等[13]设计了一种磁分选细胞装置。结合了抗人CD3的蛋白质修饰的顺磁性磁珠进入通道后被外加磁铁产生的磁场捕获固定在芯片上，引入血液样品后抗人CD3分子与T细胞表面的抗原受体紧密结合，借助磁场收集T细胞。磁力方法可手动完成，不需要昂贵仪器，对细胞损伤小。
2.3 细胞溶膜
细胞溶膜是进行细胞组分分析的重要步骤。目前基于芯片的细胞溶膜方法主要有化学试剂溶膜法、电场溶膜法、电泳缓冲液溶膜法、机械溶膜法等。
2.3.1 化学试剂溶膜法
常见的化学溶膜剂主要有十二烷基磺酸钠、毛地黄皂苷、强碱如NaOH等。Lee等[14]设计了一种新颖的芯片在线溶膜方法。由电极产生的OH-进入细胞膜，诱使细胞溶膜。溶膜完毕之后，芯片电极上产生H+中和多余的OH-，无需另外的清洗步骤。他们又对仓鼠细胞、红细胞等进行了溶膜实验，并且对其细胞胞液进行了分析测定。
2.3.2 电溶膜法
Ramsey小组[15]采用高频振荡电压使细胞破碎，同时在另一通道中加乳化剂溶解细胞碎片，交变电场的使用降低了焦耳热，能够在33 ms内完成细胞的溶膜。
2.3.4 机械力裂解溶膜法
Carlo等[16]发展了一种利用机械力裂解细胞的微流控芯片装置。其中的微流控细胞过滤区域集中了大量的纳米尺寸的尖刺，当细胞接触这些尖刺后被机械力裂解。
2.4 细胞组分分析
细胞内组分复杂, 对细胞内成分的分析和测定对于研究体内细胞代谢过程、信号转导等具有重大的意义。
Ramsey小组[17]在微流控芯片上实现了单细胞内标记染料的分离及检测。其做法是先使染料自由渗透进入细胞内部，再将细胞溶膜，然后进行芯片毛细管电泳分离。Zare研究组[18]将细胞分析的全部步骤集成在了微流控芯片上,包括细胞操纵、试剂引入及运输、细胞裂解、胞内氨基酸荧光标记、电泳分离及LIF检测实现了6种氨基酸的分离检测。最近,他们[19]又以类似的方法测定了单个昆虫细胞中的低拷贝蛋白数。
3发展前景
随着纳米技术材料的出现、微加工技术的发展和电化学、光学和计算机等学科的介入, 微流控芯片在细胞方面的应用朝着微型化、集成化、高灵敏度及高通量的方向发展。可以展望芯片在细胞分析领域的应用将越来越广阔。
【参考文献】
[1] Gallet, F, etal. Biologie Clinique. 2004 , 62: 85-86.
[2] Manz, A, Graber, N, etal. Sens. Actuators, B. 1990, B: 244-248.
[3] 林炳承,中国药科大学学报, 2003，34, 1：1-6.
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[7] E. Gottwald, etal. Lab Chip. 2007, 7: 777-785.
[8] Huang, W. H, Cheng, J. K, etal. Anal. Chem. 2004, 76: 483-486.
[9] Wakamoto, Y, etal. Fresenius J. Anal. Chem. 2001, 371: 276-281.
[10] Thomas D. Perroud, etal. Anal. Chem. 2008, 80: 6365-6372.
[11] Yasukawa T, etal. Anal. Chem. 2008, 80: 3722-3727.
[12] Miiller T, Gradl G, et al. Biosens. Bioelectron. 1999, 14: 247-256
[13] Vasile I. Furdui, etal. Lab Chip, 2004, 4: 614-618.
[14] Carlo, D. D, Lee, L. P. Lab Chip. 2005, 5: 171-178.
[15] Culbertson, C. T, etal. Anal. Chem. 2003, 75: 5646-5655.
[16] Carlo,D. D, etal. Lab.Chip. 2003, 3: 287-291.
[17] McClain M A, et a1. Anal Chem, 2003, 75: 5646-5655.
[18] Wu H,etal.Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 2004,101：12809-12813
[19] Huang B et al. Science, 2007, 315: 81-84.
The Studies on Single Cell Based on a Microchip
Xiaocong Gong＊Qingling LiBo TangHongbo Zhong
(College of Chemistry, Chemical Engineering and Materials Science, Key Laboratory of Molecular and Nano Probes, Ministry of Education, Shandong Normal University, Jinan, 250014)
【Abstract】Cells are fundamental unit of morphological configuration and vital activity of organisms. Studies on single cell will obtain more accurate and general information about the physical state and progress. Due to micron level dimension and network configuration, the studies on single cells on a microfluidic chip have made significant development. In this article, the applications of microchip on cell culture, manipulation, lysis and analysis are reviewed.
【Keywords】microfluidic chip; cell culture; cell manipulation; cell lysis, cell analysis
作者简介：
公晓聪（1982.1--），女，山东省临沂市人, 山东师范大学化学化工与材料科学学院,分析化学