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【摘要】 目的：建立慢性间歇性低氧大鼠模型，探讨雌激素对CIH大鼠SRCa2+-ATPase活性及其基因表达的影响,探索雌激素保护OSAHS的分子生物学机制。方法：32只成年雌性大鼠随机分4组:①对照组（NC）、②慢性间歇性低氧组（CIH）、③慢性间歇性低氧去卵巢组（CIH+ OVX）、④慢性间歇性低氧去卵巢回补雌激素组（CIH+OVX+E2）。检测颏舌肌SR Ca2+ -ATPase活性，荧光定量RT-PCR测定SR Ca2+-ATP酶 mRNA表达的变化。结果：1.CIH組颏舌肌SR Ca2+-ATP 酶活性及基因表达水平比NC组降低。2.CIH+OVX组颏舌肌SR Ca2+-ATP 酶活性及其基因表达较CIH组明显降低(P<0.01)。3.CIH+OVX+E2组颏舌肌SR Ca2+-ATP 酶活性及其基因表达较CIH+OVX组明显上升(P<0.01)。结论：1.CIH成年雌鼠随着雌激素水平的变化SR Ca2+-ATP 酶活性及其mRNA的表达也有相应的变化，雌激素可能通过该途径改变颏舌肌功能。2.慢性进行性低氧可能引起成年雌鼠颏舌肌Ca2+-ATP 酶活性降低其mRNA的表达下降，可能是其导致颏舌肌疲劳的途径之一。3.回补雌激素时去势CIH雌鼠的SR Ca2+-ATP 酶活性增加其基因表达上升，可能是雌激素对OSAHS患者起保护作用的机制之一。
【关键词】 阻塞性睡眠呼吸低通气暂停综合征；慢性进行性低氧；颏舌肌；雌激素；肌浆网钙泵
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）以夜间反复发作的上气道阻塞为特征,其中50％－75％阻塞发生在上气道口咽部[1]。颏舌肌是最重要的上气道扩大肌,其收缩使舌体向前运动从而有效开放舌后气道,上气道口咽部扩大,其功能异常则导致上气道的塌陷甚至闭合。绝经OSAHS女性患者发病的一个危险信号，绝经后女性OSAHS的患病率明显增加[2]，而接受雌激素替代治疗的患者OSAHS症状缓解，临床研究证实雌激素替代疗法能增强绝经期女性颏舌肌活性，从而对女性OSAHS患者起保护作用[3]。
1 材料和方法
1.1 建立动物模型 32只8周龄Sprague-Dawley健康雌性大鼠32只(购自中国科学院实验动物中心，体重220－250g)随机分成4组：①对照组（NC），②慢性间歇性低氧组（CIH），③慢性间歇性低氧去卵巢组（CIH+ OVX），④慢性间歇性低氧去卵巢回补雌激素组（CIH+OVX+E2），每组8只。⑴第1日将CIH+OVX组、CIH+OVX+E2组大鼠1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物(35mg/kg)，切除卵巢。⑵ 第2周起CIH+OVX+E2组大鼠开始回补17-β雌二醇每次40μg/kg, 3次/周×5周。⑶第2周起将CIH组、CIH+OVX组、CIH+OVX+E2组大鼠置于低氧动物舱内（参照Michelle McGuire的方法[4]建立），每天8小时，每周5天，共5周。⑷NC组大鼠每日同时置于相同规格通风橱内，无低氧处理。
1.2 颏舌肌SR标本的提取 处死动物后，迅速分离颌下区肌肉，充分暴露颏舌肌，一侧颏舌肌用于颏舌肌 SR Ca2 +-ATPase 活性检测另一侧颏舌肌用于颏舌肌 SR Ca2 +-ATPase mRNA 的测定分析。
1.3 颏舌肌 SR Ca2+-ATPase 活性检测 用定磷法测定。酶活性单为μmol Pi ／( mg protein · hour)。
1.4 颏舌肌 SR SR Ca2+-ATPase mRNA 的测定 组织匀浆，100mg组织/1ml Trizol Reagent 液，通过氯仿/异丙醇/乙醇方法提取总RNA，紫外分光光度仪测定其纯度和含量，1%甲醛变性凝胶电泳检测其完整性。合成引物序列如下：正义链（Sense）为：5’- AAGATAAGGCTAAGGAGTGATG-3’，反义链（AntiSense）为：5’- ATAAGGGACGCAAAGGTG -3’，限定片断长为194bp。荧光定量PCR反应条件为:95℃30 s－{95℃ 5s－55℃ 5s－72℃ 15s (40cycles)}熔解曲线（Melting Curve）电脑自动报告Ct(cycle threshold)数据。
1.5 统计分析 用SPSS 12.0 for Windows 统计分析软件对实验结果进行统计分析，数据用Mean ± SD 表示，组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA）统计学方法，两组间的比较用L-S-D统计学方法。
2 结果
2.1 各组雌性大鼠颏舌肌 SR Ca2+-ATPase 活性比较
与NC组相比，CIH组颏舌肌SR Ca2+-ATPase活性明显降低仅为对照组的71％（P＜0.01）。而建立CIH的三组模型中，CIH＋OVX组颏舌肌SR Ca2+-ATPase活性较CIH组大幅下降仅为其67％(P＜0.01) 而回补雌激素后CIH+OVX+E2组颏舌肌SR Ca2+-ATPase活性的表达明显升高达到CIH+OVX组的157％。（P＜0.01）。（见表1）
表1 各组雌性大鼠颏舌肌 SR Ca2+-ATPase 活性比较Mean ± SD
注：①P<0.01,同NC组比较;②P<0.01,同 CIH组比较;③P<0.01, 同CIH+OVX
2.2 各组雌性大鼠颏舌肌 SERCA 基因的表达 1%甲醛变性凝胶电泳鉴定18S与28S条带清晰,RNA无明显降解。颏舌肌组织内SERCA荧光定量PCR 扩增曲线、熔解曲线。（见图 A B ）
图A. SERCA的反应循环次数与荧光强度关系曲线；B. SERCA扩增产物的熔解曲线
我们以对照组的基因CT值作为参照，将电脑自动汇报的CT值，带入公式△Ct=目的基因Ct-内参Ct,再进而计算出2△Ct从而以此反映各组大鼠SERCA基因表达量的差别。统计学分析，发现与对照组相比，CIH组颏舌肌 SERCA mRNA表达明显降低（P＜0.01）。而建立CIH的三组模型中，CIH＋OVX组较CIH组较去卵巢组大幅下降仅为其20％(P＜0.01) 而回补雌激素后SERCAmRNA的表达明显升高达到CIH+OVX组的350％。（P＜0.01）。
3 讨论
研究证实,上气道扩张肌活动异常与OSAHS发病有密切关系[5]。上气道扩大肌的疲劳性增加，可能是OSAHS患者上气道稳定性降低的原因之一，而细胞内钙稳态失衡与骨骼肌疲劳性增加具有十分密切的关系。钙稳态的维持有赖于骨骼肌膜,肌浆网及线粒体内存在的复杂而完整的钙转运系统，肌浆网(SR )是这一转运系统的中心环节。肌浆网Ca2+- ATPase活性下降时，SR对Ca2+ 的再摄取能力下降，一方面细胞浆中游离Ca2+ 浓度增加，进而激活蛋白水解酶和磷脂酶等造成肌纤维蛋白的降解，结构破坏，引起肌肉收缩机能的下降；另一方面由于再摄取SR的Ca2+ 量减少，速度减慢，使肌球蛋白和肌动蛋白形成的横桥分离速度减慢，影响肌肉的舒张，最终导致肌肉疲劳性增加。
流病学调查显示OSAHS的发病有显著的性别差异性,男女比例约为2～3：1[6]绝经后女性OSAHS发病明显上升，而接受雌激素替代治疗的患者OSAHS发病率下降或症状缓解。颏舌肌因其重要的解剖位置和功能而被称为上气道的“安全肌”。
本实验研究结果表明CIH雌性大鼠模型随着雌激素水平的改变其肌浆网钙泵ATPase及其基因表达也会有相应的变化。CIH+OVX模型肌浆网钙ATPase的活性是CIH组60%(P< 0.01)而CIH+OVX+E2組ATPase的活性则回复至接近CIH模型水平(P>0.05) 。同时各CIH模型随着其雌激素水平的变化其肌浆网钙ATPase的基因表达也发生了同向性变化。说明在慢性进行性缺氧模型的基础上，肌浆网钙泵活性及其基因表达可以随着雌激素水平的变化而发生相应的改变。雌激素有可能通过调节颏舌肌功能的途径影响上气道的稳定性,从而对女性OSAHS患者起到保护作用。
参考文献
［1］Ayappa I, Rapoport DM. The upper airway in sleep: physiology of the pharynx. Sleep Med Rev, 2003, 7(1): 9～33
［2］Bixler EO, Vgontzas AN, Lin HM, et al. Prevalence of sleep-disordered breathing in women: effects of gender. Am J Respi Crit Care Med, 2001, 163: 608～613
［3］Manber R, Kuo TF, Cataldo N, et al. The effects of hormone replacement therapy on sleep-disordered breathing in postmenopausal women: A pilot study.Sleep,2003,26(2):163
［4］Michelle McGuire, Mary MacDermott, Aidan Bradford. Effects of Chronic Inermittent Asphyxia on Rat Diaphragm and Limb Muscle Contractility. Chest,2003,123(3):875-881
［5］Andrea Barral Martins, Sérgio Tufik, Sonia Maria Guimaraes Pereira Togeiro Moura. Physiopathology of obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome.J Bras Pneumol. 2007;33(1):93-100
［6］Naresh M. Punjabi.The Epidemiology of Adult Obstructive Sleep Apnea. risks imposed by obstructive sleep apnea. Proc Am Thorac Soc. 2008, 5 :136-143
【关键词】 阻塞性睡眠呼吸低通气暂停综合征；慢性进行性低氧；颏舌肌；雌激素；肌浆网钙泵
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）以夜间反复发作的上气道阻塞为特征,其中50％－75％阻塞发生在上气道口咽部[1]。颏舌肌是最重要的上气道扩大肌,其收缩使舌体向前运动从而有效开放舌后气道,上气道口咽部扩大,其功能异常则导致上气道的塌陷甚至闭合。绝经OSAHS女性患者发病的一个危险信号，绝经后女性OSAHS的患病率明显增加[2]，而接受雌激素替代治疗的患者OSAHS症状缓解，临床研究证实雌激素替代疗法能增强绝经期女性颏舌肌活性，从而对女性OSAHS患者起保护作用[3]。
1 材料和方法
1.1 建立动物模型 32只8周龄Sprague-Dawley健康雌性大鼠32只(购自中国科学院实验动物中心，体重220－250g)随机分成4组：①对照组（NC），②慢性间歇性低氧组（CIH），③慢性间歇性低氧去卵巢组（CIH+ OVX），④慢性间歇性低氧去卵巢回补雌激素组（CIH+OVX+E2），每组8只。⑴第1日将CIH+OVX组、CIH+OVX+E2组大鼠1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物(35mg/kg)，切除卵巢。⑵ 第2周起CIH+OVX+E2组大鼠开始回补17-β雌二醇每次40μg/kg, 3次/周×5周。⑶第2周起将CIH组、CIH+OVX组、CIH+OVX+E2组大鼠置于低氧动物舱内（参照Michelle McGuire的方法[4]建立），每天8小时，每周5天，共5周。⑷NC组大鼠每日同时置于相同规格通风橱内，无低氧处理。
1.2 颏舌肌SR标本的提取 处死动物后，迅速分离颌下区肌肉，充分暴露颏舌肌，一侧颏舌肌用于颏舌肌 SR Ca2 +-ATPase 活性检测另一侧颏舌肌用于颏舌肌 SR Ca2 +-ATPase mRNA 的测定分析。
1.3 颏舌肌 SR Ca2+-ATPase 活性检测 用定磷法测定。酶活性单为μmol Pi ／( mg protein · hour)。
1.4 颏舌肌 SR SR Ca2+-ATPase mRNA 的测定 组织匀浆，100mg组织/1ml Trizol Reagent 液，通过氯仿/异丙醇/乙醇方法提取总RNA，紫外分光光度仪测定其纯度和含量，1%甲醛变性凝胶电泳检测其完整性。合成引物序列如下：正义链（Sense）为：5’- AAGATAAGGCTAAGGAGTGATG-3’，反义链（AntiSense）为：5’- ATAAGGGACGCAAAGGTG -3’，限定片断长为194bp。荧光定量PCR反应条件为:95℃30 s－{95℃ 5s－55℃ 5s－72℃ 15s (40cycles)}熔解曲线（Melting Curve）电脑自动报告Ct(cycle threshold)数据。
1.5 统计分析 用SPSS 12.0 for Windows 统计分析软件对实验结果进行统计分析，数据用Mean ± SD 表示，组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA）统计学方法，两组间的比较用L-S-D统计学方法。
2 结果
2.1 各组雌性大鼠颏舌肌 SR Ca2+-ATPase 活性比较
与NC组相比，CIH组颏舌肌SR Ca2+-ATPase活性明显降低仅为对照组的71％（P＜0.01）。而建立CIH的三组模型中，CIH＋OVX组颏舌肌SR Ca2+-ATPase活性较CIH组大幅下降仅为其67％(P＜0.01) 而回补雌激素后CIH+OVX+E2组颏舌肌SR Ca2+-ATPase活性的表达明显升高达到CIH+OVX组的157％。（P＜0.01）。（见表1）
表1 各组雌性大鼠颏舌肌 SR Ca2+-ATPase 活性比较Mean ± SD
注：①P<0.01,同NC组比较;②P<0.01,同 CIH组比较;③P<0.01, 同CIH+OVX
2.2 各组雌性大鼠颏舌肌 SERCA 基因的表达 1%甲醛变性凝胶电泳鉴定18S与28S条带清晰,RNA无明显降解。颏舌肌组织内SERCA荧光定量PCR 扩增曲线、熔解曲线。（见图 A B ）
图A. SERCA的反应循环次数与荧光强度关系曲线；B. SERCA扩增产物的熔解曲线
我们以对照组的基因CT值作为参照，将电脑自动汇报的CT值，带入公式△Ct=目的基因Ct-内参Ct,再进而计算出2△Ct从而以此反映各组大鼠SERCA基因表达量的差别。统计学分析，发现与对照组相比，CIH组颏舌肌 SERCA mRNA表达明显降低（P＜0.01）。而建立CIH的三组模型中，CIH＋OVX组较CIH组较去卵巢组大幅下降仅为其20％(P＜0.01) 而回补雌激素后SERCAmRNA的表达明显升高达到CIH+OVX组的350％。（P＜0.01）。
3 讨论
研究证实,上气道扩张肌活动异常与OSAHS发病有密切关系[5]。上气道扩大肌的疲劳性增加，可能是OSAHS患者上气道稳定性降低的原因之一，而细胞内钙稳态失衡与骨骼肌疲劳性增加具有十分密切的关系。钙稳态的维持有赖于骨骼肌膜,肌浆网及线粒体内存在的复杂而完整的钙转运系统，肌浆网(SR )是这一转运系统的中心环节。肌浆网Ca2+- ATPase活性下降时，SR对Ca2+ 的再摄取能力下降，一方面细胞浆中游离Ca2+ 浓度增加，进而激活蛋白水解酶和磷脂酶等造成肌纤维蛋白的降解，结构破坏，引起肌肉收缩机能的下降；另一方面由于再摄取SR的Ca2+ 量减少，速度减慢，使肌球蛋白和肌动蛋白形成的横桥分离速度减慢，影响肌肉的舒张，最终导致肌肉疲劳性增加。
流病学调查显示OSAHS的发病有显著的性别差异性,男女比例约为2～3：1[6]绝经后女性OSAHS发病明显上升，而接受雌激素替代治疗的患者OSAHS发病率下降或症状缓解。颏舌肌因其重要的解剖位置和功能而被称为上气道的“安全肌”。
本实验研究结果表明CIH雌性大鼠模型随着雌激素水平的改变其肌浆网钙泵ATPase及其基因表达也会有相应的变化。CIH+OVX模型肌浆网钙ATPase的活性是CIH组60%(P< 0.01)而CIH+OVX+E2組ATPase的活性则回复至接近CIH模型水平(P>0.05) 。同时各CIH模型随着其雌激素水平的变化其肌浆网钙ATPase的基因表达也发生了同向性变化。说明在慢性进行性缺氧模型的基础上，肌浆网钙泵活性及其基因表达可以随着雌激素水平的变化而发生相应的改变。雌激素有可能通过调节颏舌肌功能的途径影响上气道的稳定性,从而对女性OSAHS患者起到保护作用。
参考文献
［1］Ayappa I, Rapoport DM. The upper airway in sleep: physiology of the pharynx. Sleep Med Rev, 2003, 7(1): 9～33
［2］Bixler EO, Vgontzas AN, Lin HM, et al. Prevalence of sleep-disordered breathing in women: effects of gender. Am J Respi Crit Care Med, 2001, 163: 608～613
［3］Manber R, Kuo TF, Cataldo N, et al. The effects of hormone replacement therapy on sleep-disordered breathing in postmenopausal women: A pilot study.Sleep,2003,26(2):163
［4］Michelle McGuire, Mary MacDermott, Aidan Bradford. Effects of Chronic Inermittent Asphyxia on Rat Diaphragm and Limb Muscle Contractility. Chest,2003,123(3):875-881
［5］Andrea Barral Martins, Sérgio Tufik, Sonia Maria Guimaraes Pereira Togeiro Moura. Physiopathology of obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome.J Bras Pneumol. 2007;33(1):93-100
［6］Naresh M. Punjabi.The Epidemiology of Adult Obstructive Sleep Apnea. risks imposed by obstructive sleep apnea. Proc Am Thorac Soc. 2008, 5 :136-143