论文部分内容阅读
[摘要] 目的 检测人类脑梗死后抑郁症(PD)中Borna病病毒(BDV)感染率,探讨BDV感染与PD的相关性。方法 采用采用巢式逆转录酶聚合酶链反应)结合荧光定量聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测35例PD患者及35例健康人外周血单个核细胞(PBMCs)中BDV P24基因片段。结果 35例PD患者和35例健康对照者外周血BDV P24基因片段检测均为阴性。PD患者BDV阳性率(0)等于健康对照(0),无差异。结论 本实验不支持BDV感染与PD的发生具有相关性。
[关键词] 脑梗死后抑郁;Borna病病毒;聚合酶链反应
[中图分类号] R743.33[中图分类号] A[文章编号] 1673-9701(2009)24-80-02
博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是一种单链、负股、非细胞溶解性的RNA病毒[1,2],具有高度嗜神经特点,是人畜共患病博尔纳病(Borna Disease,BD)的病原体,可引起从鸟到灵长类的多种动物的中枢神经系统感染[3],表现为以中枢神经系统功能障碍为特征的BD。近年研究发现,BDV感染与一些神经精神疾病的发病有关,尤其与精神疾病的发生[4],但有关BDV感染与脑梗死后抑郁症(Poststroke depression,PD)发病之间的关系目前国内外研究少有报道。本研究采用巢式逆转录酶聚合酶链反应结合荧光定量聚合酶链反应(Fluorescence quantitative nested RT-PCR,FQ-nRT-PCR),从分子生物学角度探讨BDV与PD的关系,现将初步结果报道如下。
1资料和方法
1.1研究对象
35例病例均系重庆市南岸区PD患者,诊断均符合美国诊断与统计手册第四版(DSM-Ⅳ)的诊断标准,均接受抑郁症常规治疗,未接受抗病毒治疗,其中男20例,女15例。35例健康对照者中男20例,女15例。两组年龄无明显差异(P>0.05)。
1.2主要试剂及仪器
引物序列为:①外引物:P1:5 TGACCCAACCAGTAGACCA 3(19bp)P2:5 GTCCCATTCATCCGTTGTC 3(19bp);②内引物:P1:5 CCCTCC AAGTGGAAACCAT 3(19bp) P2:5 CAGTATCT TGATGTTCTCGCCA3(22bp);③β-actin引物P1:5 ACTCCTA CGTGGGCGACGAG3(20bp); P2: 5 CAGGTCCAGACGCAGGAT GGC 3(21bp)由上海英骏生物有限公司合成;④荧光探针:5-FAM-TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGC-TAMRA-3(25bp)由中山医科大学达安基因诊断中心合成。Roter-gene3000荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett Research 公司)。
1.3实验方法
参照赵立波[5]等建立的方法进行。
RNA样本质量检测和nRT-PCR结合FQ-PCR检测BDV p24。参照徐平等[6]建立的方法进行,并运用Roter-gene 3000荧光定量PCR仪6.0版本自动进行实时定量分析。
1.4统计学处理
采用SAS软件9.0进行Fisher精确概率检验。
2结果
2.1PBMCs总RNA的提取质量
每组随机提取4例RNA样本用紫外分光光度计测OD260、OD280,计算OD260/OD280值。DD组OD260/OD280分别为1.86、1.85、1.96、1.92;健康对照组OD260/OD280分别为1.81、1.92、1.81、1.88。作琼脂糖凝胶电泳显示明显的28S、18S、5S三条带,说明RNA样品纯度高、完整性好、无降解。
2.2第一轮PCR扩增产物电泳
第一轮扩增的PCR产物作琼脂糖凝胶电泳显示每例样本的β-actin的基因片断均阳性。阴性对照显示为阴性。说明逆转录和第一轮扩增的PCR成功进行。
2.3FQ-PCR定量结果
对第二轮扩增的PCR产物运用Roter-gene 3000 荧光定量PCR仪6.0版本分析软件进行分析。五个梯度阳性对照均扩增成功,扩增曲线呈S形,阴性对照无荧光量改变,其ct值和浓度对数值之间的相关系数均在0.99以上,接近1,说明循环ct值和定量浓度对数值二者之间相关性好,样本定量较准确。35例PD患者和35例健康人均为阴性(图1)。
2.4统计学结果
PD组和健康对照组BDV P24基因片段阳性率均为0,两组阳性率无差异。
3讨论
研究发现[3],BDV是一种能引起人畜共患病BD的高度嗜神经RNA 病毒,分布不仅包括欧洲、北美洲,还包括日本、以色列、伊朗和中国部分地区,可能通过血液、唾液、尿液及粪便等途径传播,可引起从鸟到灵长类的多种动物的中枢神经系统感染,表现为以精神行为异常为主要特征的中枢神经系统功能障碍。近年研究发现BDV可能参与包括DD、精神分裂症、帕金森病、慢性吉兰-巴雷综合征、病毒性脑炎、慢性疲劳综合征等在内的人类神经精神疾病的发生。国外研究者们在动物模型上已经证实BDV感染可以通过对星形胶质细胞功能的影响、干预HMGB 1蛋白信号转导、干预神经营养因子信号转导三种分子机制干预神经元可塑性,影响脑内神经元的存活和发育及其功能,导致脑功能损害,引起宿主精神、行为的异常。众多研究发现,在DD急性期外周血中BDV抗原滴度明显高于健康对照组,且与抑郁的程度具有一致性,已经成功从DD患者PBMCs中分离出BDV,对急性期DD患者使用金刚完胺抗病毒治疗疗效明显,因此有理由认为BDV感染与DD发病有关。我们前期研究显示重庆市南岸区存在精神疾病患者感染BDV可能[5],PD发病率高,但机制尚不清楚。关于PD与BDV感染的关系研究报道少有。本研究运用FQ-nRT-PCR检测PD患者和健康人PBMCs中BDV P24基因片段,结果35例PD患者均为阴性,35例健康人亦均为阴性,两组阳性率为0(0/35),无差异。本实验不支持BDV与PD的发生具有相关性。虽本实验所采用方法FQ-nRT-PCR的特异性和敏感性均较一般的RT-PCR方法高,但因本实验中样本量相对较少,不能排除BDV感染与PD的发生具有相关性,有待增加样本量加以进一步的研究。
[参考文献]
[1] BrieseT, Dela Torre JC. Borna disease virus,a negative-strand RNA virus, transcribes in the nucleus of infected cells[J]. ProcNatl AcadSciUSA,1992,89:11486-11489.
[2] Cubitt B,OldstoneC,Dela TorreJC,et al. Sequence and genome organization of Borna disease virus J[J]. Virol,1994,68:1382-1396.
[3] Staeheli P, Sauder C, Hausmann J, et al. Epidemiology of Borna disease virus[J]. J Gen Virol,2000,81(9):2123.
[4] Thomas DR,Chalmers RM,Crook B,et al. Borna disease virus and mental health: a cross-sectional study[J]. QJM,2005,98(4):247.
[5] 赵立波,谢鹏,李亚军,等. 精神分裂症患者血液标本检测博尔纳病病毒核酸[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(12):1101.
(收稿日期:2009-03-16)
[关键词] 脑梗死后抑郁;Borna病病毒;聚合酶链反应
[中图分类号] R743.33[中图分类号] A[文章编号] 1673-9701(2009)24-80-02
博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是一种单链、负股、非细胞溶解性的RNA病毒[1,2],具有高度嗜神经特点,是人畜共患病博尔纳病(Borna Disease,BD)的病原体,可引起从鸟到灵长类的多种动物的中枢神经系统感染[3],表现为以中枢神经系统功能障碍为特征的BD。近年研究发现,BDV感染与一些神经精神疾病的发病有关,尤其与精神疾病的发生[4],但有关BDV感染与脑梗死后抑郁症(Poststroke depression,PD)发病之间的关系目前国内外研究少有报道。本研究采用巢式逆转录酶聚合酶链反应结合荧光定量聚合酶链反应(Fluorescence quantitative nested RT-PCR,FQ-nRT-PCR),从分子生物学角度探讨BDV与PD的关系,现将初步结果报道如下。
1资料和方法
1.1研究对象
35例病例均系重庆市南岸区PD患者,诊断均符合美国诊断与统计手册第四版(DSM-Ⅳ)的诊断标准,均接受抑郁症常规治疗,未接受抗病毒治疗,其中男20例,女15例。35例健康对照者中男20例,女15例。两组年龄无明显差异(P>0.05)。
1.2主要试剂及仪器
引物序列为:①外引物:P1:5 TGACCCAACCAGTAGACCA 3(19bp)P2:5 GTCCCATTCATCCGTTGTC 3(19bp);②内引物:P1:5 CCCTCC AAGTGGAAACCAT 3(19bp) P2:5 CAGTATCT TGATGTTCTCGCCA3(22bp);③β-actin引物P1:5 ACTCCTA CGTGGGCGACGAG3(20bp); P2: 5 CAGGTCCAGACGCAGGAT GGC 3(21bp)由上海英骏生物有限公司合成;④荧光探针:5-FAM-TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGC-TAMRA-3(25bp)由中山医科大学达安基因诊断中心合成。Roter-gene3000荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett Research 公司)。
1.3实验方法
参照赵立波[5]等建立的方法进行。
RNA样本质量检测和nRT-PCR结合FQ-PCR检测BDV p24。参照徐平等[6]建立的方法进行,并运用Roter-gene 3000荧光定量PCR仪6.0版本自动进行实时定量分析。
1.4统计学处理
采用SAS软件9.0进行Fisher精确概率检验。
2结果
2.1PBMCs总RNA的提取质量
每组随机提取4例RNA样本用紫外分光光度计测OD260、OD280,计算OD260/OD280值。DD组OD260/OD280分别为1.86、1.85、1.96、1.92;健康对照组OD260/OD280分别为1.81、1.92、1.81、1.88。作琼脂糖凝胶电泳显示明显的28S、18S、5S三条带,说明RNA样品纯度高、完整性好、无降解。
2.2第一轮PCR扩增产物电泳
第一轮扩增的PCR产物作琼脂糖凝胶电泳显示每例样本的β-actin的基因片断均阳性。阴性对照显示为阴性。说明逆转录和第一轮扩增的PCR成功进行。
2.3FQ-PCR定量结果
对第二轮扩增的PCR产物运用Roter-gene 3000 荧光定量PCR仪6.0版本分析软件进行分析。五个梯度阳性对照均扩增成功,扩增曲线呈S形,阴性对照无荧光量改变,其ct值和浓度对数值之间的相关系数均在0.99以上,接近1,说明循环ct值和定量浓度对数值二者之间相关性好,样本定量较准确。35例PD患者和35例健康人均为阴性(图1)。
2.4统计学结果
PD组和健康对照组BDV P24基因片段阳性率均为0,两组阳性率无差异。
3讨论
研究发现[3],BDV是一种能引起人畜共患病BD的高度嗜神经RNA 病毒,分布不仅包括欧洲、北美洲,还包括日本、以色列、伊朗和中国部分地区,可能通过血液、唾液、尿液及粪便等途径传播,可引起从鸟到灵长类的多种动物的中枢神经系统感染,表现为以精神行为异常为主要特征的中枢神经系统功能障碍。近年研究发现BDV可能参与包括DD、精神分裂症、帕金森病、慢性吉兰-巴雷综合征、病毒性脑炎、慢性疲劳综合征等在内的人类神经精神疾病的发生。国外研究者们在动物模型上已经证实BDV感染可以通过对星形胶质细胞功能的影响、干预HMGB 1蛋白信号转导、干预神经营养因子信号转导三种分子机制干预神经元可塑性,影响脑内神经元的存活和发育及其功能,导致脑功能损害,引起宿主精神、行为的异常。众多研究发现,在DD急性期外周血中BDV抗原滴度明显高于健康对照组,且与抑郁的程度具有一致性,已经成功从DD患者PBMCs中分离出BDV,对急性期DD患者使用金刚完胺抗病毒治疗疗效明显,因此有理由认为BDV感染与DD发病有关。我们前期研究显示重庆市南岸区存在精神疾病患者感染BDV可能[5],PD发病率高,但机制尚不清楚。关于PD与BDV感染的关系研究报道少有。本研究运用FQ-nRT-PCR检测PD患者和健康人PBMCs中BDV P24基因片段,结果35例PD患者均为阴性,35例健康人亦均为阴性,两组阳性率为0(0/35),无差异。本实验不支持BDV与PD的发生具有相关性。虽本实验所采用方法FQ-nRT-PCR的特异性和敏感性均较一般的RT-PCR方法高,但因本实验中样本量相对较少,不能排除BDV感染与PD的发生具有相关性,有待增加样本量加以进一步的研究。
[参考文献]
[1] BrieseT, Dela Torre JC. Borna disease virus,a negative-strand RNA virus, transcribes in the nucleus of infected cells[J]. ProcNatl AcadSciUSA,1992,89:11486-11489.
[2] Cubitt B,OldstoneC,Dela TorreJC,et al. Sequence and genome organization of Borna disease virus J[J]. Virol,1994,68:1382-1396.
[3] Staeheli P, Sauder C, Hausmann J, et al. Epidemiology of Borna disease virus[J]. J Gen Virol,2000,81(9):2123.
[4] Thomas DR,Chalmers RM,Crook B,et al. Borna disease virus and mental health: a cross-sectional study[J]. QJM,2005,98(4):247.
[5] 赵立波,谢鹏,李亚军,等. 精神分裂症患者血液标本检测博尔纳病病毒核酸[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(12):1101.
(收稿日期:2009-03-16)