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摘要：收集具有丰富遗传多样性的种质资源是玉米育种的前提，通过对资源进行杂种优势群的划分可以显著提高育种效率。本研究利用135对InDel分布在玉米10条染色体上的分子标记引物，系统分析了491份玉米自交系的遗传多样性，结果显示标记多态性信息量变化范围为0.255～0.678。通过计算遗传相似值（GS），上述材料被划分成8个包括Reid群、Lancaster群、四平头群和PB群的杂种优势群。本研究结果为组配优良玉米杂交种提供了遗传信息。
关键词：玉米；分子标记；遗传多样性；杂种优势群；遗传相似性；InDel标记
中图分类号： S513.03文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0107-03
收稿日期：2015-08-24
基金项目：江苏省自然科学基金（编号：BK20141385）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（13）3060]。
作者简介：林峰（1978—），男，博士，助理研究员，主要从事遗传育种研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：赵涵，博士，研究员，主要从事作物遗传育种研究。Tel：（025）84390751；E-mail：[email protected]。杂种优势是指2个遗传组成不同的生物体杂交后的杂种一代在生长势、生活力、抗逆性、产量及品质等方面优于双亲的现象。利用杂种优势获得总体性状优于亲本的杂交种是现代育种的重要手段之一。而杂种优势群集中了大量有利基因，群间自交系杂交时往往可以获得较大的杂种优势。因此，杂种优势群的划分有助于自交系改良和杂交种选配，对杂交育种具有重要意义。
玉米是典型的异交作物，杂种优势明显。玉米中最早的一对杂种优势模式是Reid×Lancaster，2003年，Hallauer提出了BSSS-Tuxpeno和non-BSSS-non-Tuxpeno两个杂种优势列（Heterotic Alignment）的概念，又称SS和NSS群[1]，这一模式大大促进了玉米种质的扩增、改良和创新，得到了广泛应用。根据系谱关系和配合力等，王懿波等将我国玉米主要种质划分为五大杂种优势群：改良Reid、Lancaster、四平头、旅大红骨以及其他杂种优势群[2]。分子标记的发展为玉米杂种优势群的划分提供了新的工具。利用RFLP和SSR标记，袁力行等将供试材料划分为四平头、旅大红骨、LSC、BSSS和PA等5个类群，划分结果与系谱分析基本一致[3]。利用SSR标记对玉米自交系进行分析，大多将其划分为6～8个杂种优势群[4-6]。
InDel标记是新一代共显性遗传标记，具有数量多、扩增产物稳定和易于检测等优点。本研究利用笔者所在研究室开发的135个InDel标记分析了491份玉米自交系的遗传多样性，并进行了杂种优势群划分，以期为这些材料的高效利用提供理论基础。
1材料与方法
1.1供试材料
所用材料为491份玉米自交系，包括X178、Q319、P138、昌7-2、黄早四、Mo17、B73、郑58等标准测验种。2014年种植于南京市蔬菜科学研究所试验地，每株系种植1行，行长 2 m，行宽40 cm，每行播种10粒。
1.2玉米InDel的发掘与标记开发
根据Romay等开发的SNP标记[7]，在多态位点附近与玉米B73基因组序列（v3）比对，利用Primer3[8]设计引物。通过电子PCR的策略在Mo17、B73、郑58、昌7-2间进行模拟PCR扩增，进一步通过cPCR软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/e-pcr/）分析标记位点的多态性，模拟中碱基错配值Mismatch≤3 bp，电子多态性筛选的候选多态性位点即可能存在1个InDel[9]。利用该引物即可作为InDel标记用于该位点的基因型检测。
1.3基因型检测
将所有自交系单株取样，植物叶片用低温真空干燥仪干燥后，采用Karroten植物基因组DNA提取试剂盒抽提DNA，具体步骤详见试剂盒说明书。DNA加适量TE溶解后，4 ℃或-20 ℃贮藏待用。PCR反应体系为25 μL，包含5 pmol两侧引物，2.5 μL 10×buffer，1.25 nmol dNTP，1 U Taq聚合酶和40 ng模板DNA。扩增程序为94 ℃预变性3 min，然后进入扩增循环：94 ℃ 30 s，55 ℃或60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃反应5 min。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离，溴化乙锭显色，凝胶成像仪上观察、照相并记录。
1.4聚类分析
筛选扩增单一条带的引物对491份玉米材料进行检测，比较不同材料里面的带型差异。InDel标记位点的多态性信息量（polymorphism information content，PIC）利用公式PIC=1-∑P2i 计算，Pi为i位点的基因频率。自交系的遗传相似值（genetic similarity，GS）由简单相配系数（simple matching coefficient，SM）计算：GS=m/（m n），m表示基因型间共有条带的数目，n表示基因型间有差异的条带数目。利用Tassel 5.0软件（www.maizegenetics.net/tassel），根据自交系标记遗传相似矩阵，通过UPGMA（unweighted pair group method）方法进行遗传距离聚类分析。
2结果与分析
2.1InDel的发掘及多态性分子标记的开发
根据B73和Mo17的测序信息，共开发135对引物，分别位于玉米的10条染色体上，平均每条染色体12.2个标记（图1）。这些标记在491份玉米材料中的多态性信息量变化范围为0.255～0.678，平均0.489，其中ID196最大，HG20最小（表1）。 2.2遗传变异分析及聚类分析
使用135个InDel标记计算491份玉米自交系之间的遗传相似系数，其范围在0.004～0.967之间，平均为0.469。根据491份玉米自交系材料的遗传相似系数矩阵，利用UPGMA 方法对上述材料进行聚类分析，将491份材料分为8个大群（图2）。根据标准测验种所代表的中国玉米生产上主要应用的杂种优势群，在聚类分析划分的群中包括Reid群（B73）、Lancaster群（Mo17）、四平头群（昌7-2，黄早四）、PB
群（X178，Q319，P138）。
3结论与讨论
玉米种质资源是育种的前提，了解其亲缘关系、划分杂种优势群有助于自交系的改良和杂交种选配，能够大大减少育种的盲目性。杂种优势群的划分一般通过系谱法、表型聚类、同工酶以及分子标记等方法。随着分子生物学的迅猛发展，DNA分子标记技术得到广泛应用。
InDel标记是指由于核苷酸插入或缺失引起的多态性标记。通过重测序比较发现，玉米不同基因型间存在着大量 InDel 变异。Lai等分析了6个中国玉米优良自交系，估算大约存在30 178个InDel，其中571个InDel位于功能基因内[10]。这些变异导致了玉米的多样性，并提供了更多的标记位点。吕远大等利用玉米基因组重测序信息，建立了大规模开发分子标记并对其进行电子多态性筛选的流程[9]。根据测序信息，笔者共开发出135对InDel标记引物，这些标记在491份玉米材料中的多态性信息量变化范围为0.255～0678，可以用于分析不同玉米材料的遗传多样性。
通过系谱或SSR标记分析，我国玉米主要种质可划分为6～8个杂种优势群[2-3]。利用InDel分子标记对491份材料进行分析后，笔者得到的分群结果与上述结果一致。主要将491份材料分为8个大群，根据标准测验种所代表的中国玉米生产上主要应用的杂种优势群，笔者在聚类分析划分的群中包括Reid群、Lancaster群、四平头群和PB群，以及一些不清楚系谱来源的材料组成的亚群。对于新划入群的材料可以根据所在杂种优势群进行有选择的交配组合。
参考文献：
[1]Hallauer A. Introgression of elite subtropical and tropical germplasm with us corn belt germlasm[C]. North Central Regional Corn Breeding Meeting，American，2003.
[2]王懿波，王振华，陆利行，等. 中国玉米种质基础、杂种优势群划分与杂优模式研究[J]. 玉米科学，1998，6（1）：9-13，28.
[3]袁力行，傅骏骅，张世煌，等. 利用RFLP和SSR标记划分玉米自交系杂种优势群的研究[J]. 作物学报，2001，27（2）：149-156.
[4]郑淑云，王守才，刘东占. 利用SSR标记划分玉米自交系杂种优势群的研究[J]. 玉米科学，2006，14（5）：26-29.
[5]李新海，袁力行，李晓辉，等. 利用SSR标记划分70份我国玉米自交系的杂种优势群[J]. 中国农业科学，2003，36（6）：622-627.
[6]赵旭，方永丰，王汉宁. 玉米SSR标记杂优类群划分及群体遗传结构分析[J]. 核农学报，2013，27（12）：1828-1838.
[7]Romay M C，Millard M J，Glaubitz J C，et al. Comprehensive genotyping of the USA National maize inbred seed bank[J]. Genome Biology，2013，14（6）：R55.
[8]Rozen S，Skaletsky H. Primer3 on the www for general users and for biologist programmers[M]//Bioinformatics methods and protocols. Berlin：Springer，1999：365-386.
[9]吕远大，李坦，石丽，等. 基于全基因组重测序信息开发玉米H99自交系特异分子标记[J]. 作物学报，2014，40（2）：191-197.
[10]Lai J S，Li R Q，Xu X，et al. Genome-wide patterns of genetic variation among elite maize inbred lines[J]. Nature Genetics，2010，42（11）：1027-1030.梁剑. 重金属镉胁迫对油橄榄幼苗生长的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：110-112.
关键词：玉米；分子标记；遗传多样性；杂种优势群；遗传相似性；InDel标记
中图分类号： S513.03文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0107-03
收稿日期：2015-08-24
基金项目：江苏省自然科学基金（编号：BK20141385）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（13）3060]。
作者简介：林峰（1978—），男，博士，助理研究员，主要从事遗传育种研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：赵涵，博士，研究员，主要从事作物遗传育种研究。Tel：（025）84390751；E-mail：[email protected]。杂种优势是指2个遗传组成不同的生物体杂交后的杂种一代在生长势、生活力、抗逆性、产量及品质等方面优于双亲的现象。利用杂种优势获得总体性状优于亲本的杂交种是现代育种的重要手段之一。而杂种优势群集中了大量有利基因，群间自交系杂交时往往可以获得较大的杂种优势。因此，杂种优势群的划分有助于自交系改良和杂交种选配，对杂交育种具有重要意义。
玉米是典型的异交作物，杂种优势明显。玉米中最早的一对杂种优势模式是Reid×Lancaster，2003年，Hallauer提出了BSSS-Tuxpeno和non-BSSS-non-Tuxpeno两个杂种优势列（Heterotic Alignment）的概念，又称SS和NSS群[1]，这一模式大大促进了玉米种质的扩增、改良和创新，得到了广泛应用。根据系谱关系和配合力等，王懿波等将我国玉米主要种质划分为五大杂种优势群：改良Reid、Lancaster、四平头、旅大红骨以及其他杂种优势群[2]。分子标记的发展为玉米杂种优势群的划分提供了新的工具。利用RFLP和SSR标记，袁力行等将供试材料划分为四平头、旅大红骨、LSC、BSSS和PA等5个类群，划分结果与系谱分析基本一致[3]。利用SSR标记对玉米自交系进行分析，大多将其划分为6～8个杂种优势群[4-6]。
InDel标记是新一代共显性遗传标记，具有数量多、扩增产物稳定和易于检测等优点。本研究利用笔者所在研究室开发的135个InDel标记分析了491份玉米自交系的遗传多样性，并进行了杂种优势群划分，以期为这些材料的高效利用提供理论基础。
1材料与方法
1.1供试材料
所用材料为491份玉米自交系，包括X178、Q319、P138、昌7-2、黄早四、Mo17、B73、郑58等标准测验种。2014年种植于南京市蔬菜科学研究所试验地，每株系种植1行，行长 2 m，行宽40 cm，每行播种10粒。
1.2玉米InDel的发掘与标记开发
根据Romay等开发的SNP标记[7]，在多态位点附近与玉米B73基因组序列（v3）比对，利用Primer3[8]设计引物。通过电子PCR的策略在Mo17、B73、郑58、昌7-2间进行模拟PCR扩增，进一步通过cPCR软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/e-pcr/）分析标记位点的多态性，模拟中碱基错配值Mismatch≤3 bp，电子多态性筛选的候选多态性位点即可能存在1个InDel[9]。利用该引物即可作为InDel标记用于该位点的基因型检测。
1.3基因型检测
将所有自交系单株取样，植物叶片用低温真空干燥仪干燥后，采用Karroten植物基因组DNA提取试剂盒抽提DNA，具体步骤详见试剂盒说明书。DNA加适量TE溶解后，4 ℃或-20 ℃贮藏待用。PCR反应体系为25 μL，包含5 pmol两侧引物，2.5 μL 10×buffer，1.25 nmol dNTP，1 U Taq聚合酶和40 ng模板DNA。扩增程序为94 ℃预变性3 min，然后进入扩增循环：94 ℃ 30 s，55 ℃或60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃反应5 min。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离，溴化乙锭显色，凝胶成像仪上观察、照相并记录。
1.4聚类分析
筛选扩增单一条带的引物对491份玉米材料进行检测，比较不同材料里面的带型差异。InDel标记位点的多态性信息量（polymorphism information content，PIC）利用公式PIC=1-∑P2i 计算，Pi为i位点的基因频率。自交系的遗传相似值（genetic similarity，GS）由简单相配系数（simple matching coefficient，SM）计算：GS=m/（m n），m表示基因型间共有条带的数目，n表示基因型间有差异的条带数目。利用Tassel 5.0软件（www.maizegenetics.net/tassel），根据自交系标记遗传相似矩阵，通过UPGMA（unweighted pair group method）方法进行遗传距离聚类分析。
2结果与分析
2.1InDel的发掘及多态性分子标记的开发
根据B73和Mo17的测序信息，共开发135对引物，分别位于玉米的10条染色体上，平均每条染色体12.2个标记（图1）。这些标记在491份玉米材料中的多态性信息量变化范围为0.255～0.678，平均0.489，其中ID196最大，HG20最小（表1）。 2.2遗传变异分析及聚类分析
使用135个InDel标记计算491份玉米自交系之间的遗传相似系数，其范围在0.004～0.967之间，平均为0.469。根据491份玉米自交系材料的遗传相似系数矩阵，利用UPGMA 方法对上述材料进行聚类分析，将491份材料分为8个大群（图2）。根据标准测验种所代表的中国玉米生产上主要应用的杂种优势群，在聚类分析划分的群中包括Reid群（B73）、Lancaster群（Mo17）、四平头群（昌7-2，黄早四）、PB
群（X178，Q319，P138）。
3结论与讨论
玉米种质资源是育种的前提，了解其亲缘关系、划分杂种优势群有助于自交系的改良和杂交种选配，能够大大减少育种的盲目性。杂种优势群的划分一般通过系谱法、表型聚类、同工酶以及分子标记等方法。随着分子生物学的迅猛发展，DNA分子标记技术得到广泛应用。
InDel标记是指由于核苷酸插入或缺失引起的多态性标记。通过重测序比较发现，玉米不同基因型间存在着大量 InDel 变异。Lai等分析了6个中国玉米优良自交系，估算大约存在30 178个InDel，其中571个InDel位于功能基因内[10]。这些变异导致了玉米的多样性，并提供了更多的标记位点。吕远大等利用玉米基因组重测序信息，建立了大规模开发分子标记并对其进行电子多态性筛选的流程[9]。根据测序信息，笔者共开发出135对InDel标记引物，这些标记在491份玉米材料中的多态性信息量变化范围为0.255～0678，可以用于分析不同玉米材料的遗传多样性。
通过系谱或SSR标记分析，我国玉米主要种质可划分为6～8个杂种优势群[2-3]。利用InDel分子标记对491份材料进行分析后，笔者得到的分群结果与上述结果一致。主要将491份材料分为8个大群，根据标准测验种所代表的中国玉米生产上主要应用的杂种优势群，笔者在聚类分析划分的群中包括Reid群、Lancaster群、四平头群和PB群，以及一些不清楚系谱来源的材料组成的亚群。对于新划入群的材料可以根据所在杂种优势群进行有选择的交配组合。
参考文献：
[1]Hallauer A. Introgression of elite subtropical and tropical germplasm with us corn belt germlasm[C]. North Central Regional Corn Breeding Meeting，American，2003.
[2]王懿波，王振华，陆利行，等. 中国玉米种质基础、杂种优势群划分与杂优模式研究[J]. 玉米科学，1998，6（1）：9-13，28.
[3]袁力行，傅骏骅，张世煌，等. 利用RFLP和SSR标记划分玉米自交系杂种优势群的研究[J]. 作物学报，2001，27（2）：149-156.
[4]郑淑云，王守才，刘东占. 利用SSR标记划分玉米自交系杂种优势群的研究[J]. 玉米科学，2006，14（5）：26-29.
[5]李新海，袁力行，李晓辉，等. 利用SSR标记划分70份我国玉米自交系的杂种优势群[J]. 中国农业科学，2003，36（6）：622-627.
[6]赵旭，方永丰，王汉宁. 玉米SSR标记杂优类群划分及群体遗传结构分析[J]. 核农学报，2013，27（12）：1828-1838.
[7]Romay M C，Millard M J，Glaubitz J C，et al. Comprehensive genotyping of the USA National maize inbred seed bank[J]. Genome Biology，2013，14（6）：R55.
[8]Rozen S，Skaletsky H. Primer3 on the www for general users and for biologist programmers[M]//Bioinformatics methods and protocols. Berlin：Springer，1999：365-386.
[9]吕远大，李坦，石丽，等. 基于全基因组重测序信息开发玉米H99自交系特异分子标记[J]. 作物学报，2014，40（2）：191-197.
[10]Lai J S，Li R Q，Xu X，et al. Genome-wide patterns of genetic variation among elite maize inbred lines[J]. Nature Genetics，2010，42（11）：1027-1030.梁剑. 重金属镉胁迫对油橄榄幼苗生长的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：110-112.