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摘要：利用5种发根农杆菌侵染不同花生外植体，对比其发根诱导率，分析寻找利于花生转化的外植体、花生品种及发根农杆菌。结果表明，农杆菌94022诱导发根率较其它发根农杆菌高；后期继代培养中子叶诱导的发根易于培养，存活率高，生长状态好；在用培养后的子叶为外植体时，花育20较其它品种发根诱导率高。
关键词：发根农杆菌；花生；外植体；发根诱导
中图分类号：S565.204.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）01-0014-03
Abstract Five kinds of Agrobacterium rhizogenes were used to infect peanut explants and the root induction rates were contrasted to find the suitable explants， peanut varieties and A. rhizogenes for peanut transformation. The results showed that A. rhizogenes 94022 had higher root induction rate than the others. The hairy roots induced from cotyledon were easy to cultivate in the successive transfer culture with higher survival rate and good growth condition. With cultured cotyledon as explants， Huayu 20 had higher root induction rate than other peanut varieties.
Key words Agrobacterium rhizogenes； Peanut； Explants； Hairy root induction
发根农杆菌能诱导大多数双子叶植物和少数单子叶植物[1]，发根农杆菌所含Ri质粒的T-DNA通过整合进入植物核基因组，并稳定表达引起宿主植物发根[2]。发根起源于单个细胞，具有生长迅速、遗传稳定、有利于高效表达克隆的筛选等特点[3]。用含改造型Ri质粒的发根农杆菌感染植物细胞可将目的基因导入植物组织再生出转基因植株[4]。并根据插入位点的多样性筛选出高效表达的发根无性系进行生产和利用，是进行次生代谢物质离体调控和大规模生产的良好体系[5]。
花生是世界上广泛种植的经济作物之一，是我国第二大食用植物油和蛋白质资源[6]。同时花生的根和茎等外植体中含有白藜芦醇[7]，建立花生发根培养体系对寻求白藜芦醇的新资源也有重要意义。本试验以5种发根农杆菌和5个花生品种及其不同部位外植体为材料，分析寻找利于花生转化的外植体、花生品种及发根农杆菌。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试花生品种：鲁花9号、丰花1号、花育20、鲁花11、花育22。所用发根农杆菌：S22、Ar-1、Ar-2、9402、94022。
1.2 试剂与培养基
试剂有乙酰丁香酮、头孢霉素、卡那霉素、利福平；培养基为MS培养基、YEB培养基。
1.3 无菌外植体的获得
分别将5个花生品种的种子在70%乙醇中浸泡1 min，用无菌水冲洗1次，然后用0.1%升汞浸泡10 min，再用无菌水清洗4次，每次4～5 min。之后种于MS培养基进行无菌萌发，6～8 d后长出无菌苗。
1.4 发根农杆菌菌株的活化与培养
分别将发根农杆菌Ar-1、Ar-2 和S22接种于添加50 mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上培养，将发根农杆菌94022和9402接种于添加50 mg/L利福平的YEB固体培养基上培养，27℃下活化3次。挑取平板上的单菌落，接种在同样添加抗生素的50 mL 的YEB液体培养基上，27℃、170 r/min黑暗下振荡培养16～18 h→在5个菌瓶中分别加入AS 1 000 μL→在27℃、170 r/min黑暗下振荡培养1 h→在A600达到 0.5～0.8时侵染外植体。
1.5 外植体转化及毛状根诱导
取灭菌后花生子叶和生长6～8 d的花生无菌苗子叶、幼叶、下胚轴、茎，各材料切成0.3～0.5 cm，并在外植体表面轻轻划出几道伤口，分别置于发根农杆菌菌液（已培养的5种）中浸泡（幼叶：10～15 min；子叶、下胚轴、茎：15～20 min）后取出，用无菌滤纸吸干外植体表面多余菌液，接种于发根诱导培养基MSo，于黑暗条件下共培养2 d。之后转接到附加500 mg/L头孢菌素的发根诱导培养基5MSo上培养3～5 d，然后转至附加300 mg/L头孢菌素的发根诱导培养基3MSo上培养12～15 d，再转至无抗生素的发根培养基上诱导发根。侵染1个月后观察统计发根诱导率。
发根诱导率=产生发根的外植体数/接种外植体总数×100%
2 结果与分析
2.1 不同发根农杆菌的发根诱导效果
由表1可看出，发根农杆菌94022的平均发根诱导率最高为54.75%，其次是9402，为46.84%，Ar-1最低为32.81%。说明发根农杆菌94022最适宜诱导花生外植体发根。
2.2 不同花生外植体的发根诱导
由表1可看出，5种花生外植体均可诱导出发根，茎和下胚轴相对其它外植体其发根诱导率较高，其次是培养后的花生子叶，幼叶的发根诱导率最低。后续发根继代培养发现花生子叶诱导的发根，生长迅速，成活率高，容易扩繁。综合比较，选择花生培养后的子叶为发根诱导外植体较为合适。 2.3 不同花生品种的发根诱导
以花生培养后子叶为外植体诱导发根时，5种发根农杆菌侵染不同花生品种的发根诱导率都以花育20为最高（表1），其中9402的诱导率为68.96%，94022的诱导率为83.20%，S22的诱导率为89.04%，Ar-1的诱导率为93.70%，Ar-2的诱导率为50.17%。
3 结论与讨论
常用的发根农杆菌对不同的植物毛状根诱导能力存在差异。Fabricio等[8]采用3种发根农杆菌ATCC15834、R1000、EHA105均诱导出毛状根。Kim等[9]采用发根农杆菌ATCC15834、A4、R1000、R1200、R1601等菌株诱导发根。姚庆收等[10]采用发根农杆菌R1601诱导，子叶没有诱导出毛状根，幼叶诱导率达65.6%，茎干诱导毛状根生长缓慢。刘杰等[11]采用发根农杆菌ACCC10060和ATCC11325诱导发根，叶片最高诱导率为53.3%。任艳等[12]采用发根农杆菌GIM1.141诱导发根，叶片诱导率为87.29%，子叶诱导率为75.8%。
本试验通过对比不同菌种和花生外植体，找到了相对适宜的组合来诱导发根进行扩繁培养。即用发根农杆菌94022侵染花育20的培养后子叶进行发根诱导，其发根诱导率相对较高，为83.20%，发根的后期继代培养存活率高，容易扩繁。
参 考 文 献：
[1]Binns A N，Tomashow M F. Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants[J]. Annul. Rev. Microbiol.，1988，42（4）：575-606.
[2]Chilton M D，Tepfer D A，Petit A，et al. Bacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genonne of host plant root cells[J]. Nature，1982，295：432-434.
[3]McKnight T D，Lillis M T，Simpson R B. Segregation of genes transferred to one plant cell from two separate Agrobacterium strains[J]. Plant Mol. Biol.，1987，8：439-445.
[4]Xu Z Q，Jia J F. Enhancement by Osmotic treatment of hairy root transformation of Alfalfa suspension cultures and chromosomal variation in the transformed tissue[J]. Aust. J. Plant Physiol.，1997，24：345-351.
[5]Stougaard J，Abildsten D and Marcker K A. The Agrobacterium rhizogene pRi TL-DNA segment as a gene vector system for transformation of plant[J]. Mol.Gen.Genet.，1987，207：251-255.
[6]Moore K M，Knauft D A. The inheritance of high oleic acid in peanut[J]. J. Hered.，1989，80：252-253.
[7]任秀莲，邢峰，解利利. 花生中白藜芦醇的研究现状及应用展望[J]. 食品研究与开发，2008，29（5）：163-166.
[8]Fabricio Medina-Bolivar，Condori J，Rimando A M，et al. Production and secretion of resveratrol in hairy root cultures of peanut[J]. Phytochemistry，2007，68：1992-2003.
[9]Kim J S，Lee S Y，Park S U. Resveratrol production in hairy root culture of peanut. Arachis hypogaea L. transformed with different Agrobacterium rhizogenes strains[J]. Afr. J. Biotechnology，2008，17：3785-3787.
[10]姚庆收，武玉永，王学全. 发根农杆菌介导的花生遗传转化体系的建立[J]. 安徽农业科学，2008，36（35）：15367-15368.
[11]刘杰，任艳，张宗申，等. 花生毛状根诱导及其体外培养[J]. 安徽农业科学，2012，40（6）：3229-3233.
[12]任艳，李磊，崔潇，等. 发根农杆菌诱导花生发根的条件优化[J]. 核农学报，2012，26（3）：439-443.
关键词：发根农杆菌；花生；外植体；发根诱导
中图分类号：S565.204.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）01-0014-03
Abstract Five kinds of Agrobacterium rhizogenes were used to infect peanut explants and the root induction rates were contrasted to find the suitable explants， peanut varieties and A. rhizogenes for peanut transformation. The results showed that A. rhizogenes 94022 had higher root induction rate than the others. The hairy roots induced from cotyledon were easy to cultivate in the successive transfer culture with higher survival rate and good growth condition. With cultured cotyledon as explants， Huayu 20 had higher root induction rate than other peanut varieties.
Key words Agrobacterium rhizogenes； Peanut； Explants； Hairy root induction
发根农杆菌能诱导大多数双子叶植物和少数单子叶植物[1]，发根农杆菌所含Ri质粒的T-DNA通过整合进入植物核基因组，并稳定表达引起宿主植物发根[2]。发根起源于单个细胞，具有生长迅速、遗传稳定、有利于高效表达克隆的筛选等特点[3]。用含改造型Ri质粒的发根农杆菌感染植物细胞可将目的基因导入植物组织再生出转基因植株[4]。并根据插入位点的多样性筛选出高效表达的发根无性系进行生产和利用，是进行次生代谢物质离体调控和大规模生产的良好体系[5]。
花生是世界上广泛种植的经济作物之一，是我国第二大食用植物油和蛋白质资源[6]。同时花生的根和茎等外植体中含有白藜芦醇[7]，建立花生发根培养体系对寻求白藜芦醇的新资源也有重要意义。本试验以5种发根农杆菌和5个花生品种及其不同部位外植体为材料，分析寻找利于花生转化的外植体、花生品种及发根农杆菌。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试花生品种：鲁花9号、丰花1号、花育20、鲁花11、花育22。所用发根农杆菌：S22、Ar-1、Ar-2、9402、94022。
1.2 试剂与培养基
试剂有乙酰丁香酮、头孢霉素、卡那霉素、利福平；培养基为MS培养基、YEB培养基。
1.3 无菌外植体的获得
分别将5个花生品种的种子在70%乙醇中浸泡1 min，用无菌水冲洗1次，然后用0.1%升汞浸泡10 min，再用无菌水清洗4次，每次4～5 min。之后种于MS培养基进行无菌萌发，6～8 d后长出无菌苗。
1.4 发根农杆菌菌株的活化与培养
分别将发根农杆菌Ar-1、Ar-2 和S22接种于添加50 mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上培养，将发根农杆菌94022和9402接种于添加50 mg/L利福平的YEB固体培养基上培养，27℃下活化3次。挑取平板上的单菌落，接种在同样添加抗生素的50 mL 的YEB液体培养基上，27℃、170 r/min黑暗下振荡培养16～18 h→在5个菌瓶中分别加入AS 1 000 μL→在27℃、170 r/min黑暗下振荡培养1 h→在A600达到 0.5～0.8时侵染外植体。
1.5 外植体转化及毛状根诱导
取灭菌后花生子叶和生长6～8 d的花生无菌苗子叶、幼叶、下胚轴、茎，各材料切成0.3～0.5 cm，并在外植体表面轻轻划出几道伤口，分别置于发根农杆菌菌液（已培养的5种）中浸泡（幼叶：10～15 min；子叶、下胚轴、茎：15～20 min）后取出，用无菌滤纸吸干外植体表面多余菌液，接种于发根诱导培养基MSo，于黑暗条件下共培养2 d。之后转接到附加500 mg/L头孢菌素的发根诱导培养基5MSo上培养3～5 d，然后转至附加300 mg/L头孢菌素的发根诱导培养基3MSo上培养12～15 d，再转至无抗生素的发根培养基上诱导发根。侵染1个月后观察统计发根诱导率。
发根诱导率=产生发根的外植体数/接种外植体总数×100%
2 结果与分析
2.1 不同发根农杆菌的发根诱导效果
由表1可看出，发根农杆菌94022的平均发根诱导率最高为54.75%，其次是9402，为46.84%，Ar-1最低为32.81%。说明发根农杆菌94022最适宜诱导花生外植体发根。
2.2 不同花生外植体的发根诱导
由表1可看出，5种花生外植体均可诱导出发根，茎和下胚轴相对其它外植体其发根诱导率较高，其次是培养后的花生子叶，幼叶的发根诱导率最低。后续发根继代培养发现花生子叶诱导的发根，生长迅速，成活率高，容易扩繁。综合比较，选择花生培养后的子叶为发根诱导外植体较为合适。 2.3 不同花生品种的发根诱导
以花生培养后子叶为外植体诱导发根时，5种发根农杆菌侵染不同花生品种的发根诱导率都以花育20为最高（表1），其中9402的诱导率为68.96%，94022的诱导率为83.20%，S22的诱导率为89.04%，Ar-1的诱导率为93.70%，Ar-2的诱导率为50.17%。
3 结论与讨论
常用的发根农杆菌对不同的植物毛状根诱导能力存在差异。Fabricio等[8]采用3种发根农杆菌ATCC15834、R1000、EHA105均诱导出毛状根。Kim等[9]采用发根农杆菌ATCC15834、A4、R1000、R1200、R1601等菌株诱导发根。姚庆收等[10]采用发根农杆菌R1601诱导，子叶没有诱导出毛状根，幼叶诱导率达65.6%，茎干诱导毛状根生长缓慢。刘杰等[11]采用发根农杆菌ACCC10060和ATCC11325诱导发根，叶片最高诱导率为53.3%。任艳等[12]采用发根农杆菌GIM1.141诱导发根，叶片诱导率为87.29%，子叶诱导率为75.8%。
本试验通过对比不同菌种和花生外植体，找到了相对适宜的组合来诱导发根进行扩繁培养。即用发根农杆菌94022侵染花育20的培养后子叶进行发根诱导，其发根诱导率相对较高，为83.20%，发根的后期继代培养存活率高，容易扩繁。
参 考 文 献：
[1]Binns A N，Tomashow M F. Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants[J]. Annul. Rev. Microbiol.，1988，42（4）：575-606.
[2]Chilton M D，Tepfer D A，Petit A，et al. Bacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genonne of host plant root cells[J]. Nature，1982，295：432-434.
[3]McKnight T D，Lillis M T，Simpson R B. Segregation of genes transferred to one plant cell from two separate Agrobacterium strains[J]. Plant Mol. Biol.，1987，8：439-445.
[4]Xu Z Q，Jia J F. Enhancement by Osmotic treatment of hairy root transformation of Alfalfa suspension cultures and chromosomal variation in the transformed tissue[J]. Aust. J. Plant Physiol.，1997，24：345-351.
[5]Stougaard J，Abildsten D and Marcker K A. The Agrobacterium rhizogene pRi TL-DNA segment as a gene vector system for transformation of plant[J]. Mol.Gen.Genet.，1987，207：251-255.
[6]Moore K M，Knauft D A. The inheritance of high oleic acid in peanut[J]. J. Hered.，1989，80：252-253.
[7]任秀莲，邢峰，解利利. 花生中白藜芦醇的研究现状及应用展望[J]. 食品研究与开发，2008，29（5）：163-166.
[8]Fabricio Medina-Bolivar，Condori J，Rimando A M，et al. Production and secretion of resveratrol in hairy root cultures of peanut[J]. Phytochemistry，2007，68：1992-2003.
[9]Kim J S，Lee S Y，Park S U. Resveratrol production in hairy root culture of peanut. Arachis hypogaea L. transformed with different Agrobacterium rhizogenes strains[J]. Afr. J. Biotechnology，2008，17：3785-3787.
[10]姚庆收，武玉永，王学全. 发根农杆菌介导的花生遗传转化体系的建立[J]. 安徽农业科学，2008，36（35）：15367-15368.
[11]刘杰，任艳，张宗申，等. 花生毛状根诱导及其体外培养[J]. 安徽农业科学，2012，40（6）：3229-3233.
[12]任艳，李磊，崔潇，等. 发根农杆菌诱导花生发根的条件优化[J]. 核农学报，2012，26（3）：439-443.